SignalStar^™ mIHC Panel 设计

在开始之前

SignalStar Multiplex IHC 技术使用特定的一抗和荧光检测试剂标记 FFPE 组织样品中的细胞蛋白。它使您能够使用经过高度验证的抗体检测板同时定量多个生物标志物，以进行空间生物学实验。

SignalStar Multiplex IHC Panel Builder 可自动进行 Panel 设计，消除了将抗体与荧光团配对的猜测，以确保准确性。在四个基本步骤中，您可以选择靶标物种、抗体、荧光团和成像序列来快速轻松地设计实验。或者，您可以选择物种和抗体，并让自动化在线Panel Builder 指导您完成其余的工作。

确认您的仪器兼容性

• SignalStar Multiplex IHC 实验步骤可以在您的实验台上手动执行，也可以在 Leica Biosystems 的 BOND RX 自动染色机上自动执行。有关仪器要求的更多详细信息，请参阅实验步骤。
  • 手动实验步骤
  • BOND RX 实验步骤
• 考虑荧光成像仪器的光谱特性，以获得最佳效果并避免光谱渗透。
• 如果您的最终检测板除了 DAPI 之外还包含所有四 (4) 个荧光通道，那么您需要确认您的荧光成像仪器可以根据以下参数专门检测和分离这些通道：

如何设计 SignalStar Multiplex IHC Panel

第 1 步：选择靶标物种

SignalStar Multiplex IHC 抗体经过验证，确认与指定物种具有特异性反应性。并非所有抗体对所有物种都有效。

第 2 步：选择抗体

针对您的目的标记物，选择 3-8 种经验证的抗体。与所有 CST^® 抗体一样，确定用于 SignalStar 检测板的抗体均经过单独验证，可用于其预期应用。因此，它们保证能够按预期发挥作用，并为您提供可靠、可重复的结果。

第 3 步：查看和编辑 Panel Builder 结果

Panel Builder 可自动设计 mIHC Panel，将抗体与荧光团配对，并以固有的准确性和效率进行成像。您可以查看并确认Panel Builder结果，或选择编辑以更好地控制您的实验设计。

设计您自己的 Multiplex IHC Panel 时的注意事项

 

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SignalStar™ Multiplex IHC 抗体和荧光团配对的注意事项

SignalStar Multiplex IHC Panel Builder 提供自动化检测板设计、抗体与荧光团配对以及高效准确的成像轮次。可以编辑检测板构建结果，从而完全控制设计。如果您选择修改检测板，请记住以下注意事项：

• 蛋白质丰度： 通道 594 和 647 最亮，应该与结合最不丰富抗原的抗体配对。通道 750 的信号强度较低，并且图形构建器将禁止某些抗体与通道 750 配对。

• 自发荧光： 预计检测组织中低丰度蛋白质的抗体应该位于受自发荧光影响较小的通道中。通道 488 受自发荧光影响最大，应避免用于这些生物标记物。

• 成像轮次： 虽然无论成像轮次如何，大多数抗体都应该强大且干净，但信号强度可能会受到靶标表达水平低和组织质量差的影响。为了获得最佳结果，针对较低丰度蛋白质的抗体应放置在第一轮成像中，而针对较高丰度标记物的抗体应放置在第二轮成像中。检测板构建器可能禁止在某些成像轮次中使用某些抗体。

• 成像仪器： 为了避免光谱渗漏，请考虑荧光显微镜的光谱特性。落射荧光显微镜、共聚焦显微镜和扫描荧光显微镜通常可以区分 SignalStar 通道：

  荧光通道	激发光波长 (nm)	发射光波长 (nm)	激光线	通用滤光器
  488	488	520	488	FITC
  594	590	618	561/594	Texas Red
  647	650	668	594/633	Cy®5
  750	752	776	633	Cy®7

  如果您的最终检测板除了 DAPI 之外还包含所有四 (4) 个荧光信道，那么您需要确认您的荧光成像仪器可以根据这些参数专门检测和分离这些信道。

• 光谱分解： SignalStar Multiplex IHC Panel 中包含的抗体、试剂和实验步骤均经过优化，可最大程度地减少光谱重叠。为了进一步确保可以区分各个抗体的荧光，我们建议使用用上述通道单独染色的切片创建光谱库。

  如果您的成像仪器的特性不适合分离这些荧光信道，则可以使用光谱库通过计算分离荧光信号。

第 4 步：确认您的订单

您的实验所需的所有抗体和缓冲液套装将自动添加到您的购物车中。您可以继续在Panel Builder中多次添加Panel。只是要小心，不要将之前已经放入购物篮中的Panel移除。

SignalStar mIHC 工作流程

SignalStar mIHC 检测可同时标记 FFPE 组织中多达 8 种生物标记物。脱蜡且再水化的 FFPE 组织切片首先经过抗原修复 (A)，然后在一步一抗孵育步骤中混合添加针对您所选靶标数目（最多 3-8 种寡核苷酸偶联抗体）的所有抗体 (B)。带荧光染料（通道：488、594、647 和 750）的互补性寡核苷酸网络通过构造与抗体接合的寡核苷酸-荧光团结构体，在第一轮成像中放大多达 4 种寡核苷酸偶联抗体的信号(C-D)。如果检测靶标的数量大于 4，则需要柔和移除第一轮成像的寡核苷酸和荧光基团 (E)，接着进行第二轮放大以可视化多达 4 种额外的寡核苷酸偶联抗体 (F)。然后将二张图片用软件进行对齐与重合，以生成 8 标染色图像 (G)。

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CST 提供专家支持，帮助您在研究中优化 SignalStar Multiplex IHC 的使用。

访问技术支持页面，搜索 SignalStar 相关的疑难问题解答信息和技术问题的答案。

Cell Signaling Technology、CST 和 SignalStar 均是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。Cy 是 GE Healthcare 的注册商标。所有其他商标均属各自所有者专有。访问 cellsignal.com/trademarks 以了解更多信息。

第 10,781,477 号美国专利，外国对应物，以及由此而来的儿童专利。