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SignalStar™ 多重免疫组织化学测定法适用于 Leica Biosystems 的 BOND RX 全自动研究染色机

产品信息：

signalstar-8plex  

储存：所有试剂盒组分都储存于 -20ºC。

稳定性：在建议的温度保存时，该试剂盒中所有组分均稳定至少 12 个月。不得超过 5 次冻/融循环。

应用：SignalStar 试剂盒适用于进行荧光多重免疫组织化学分析。

载玻片数目：该试剂盒包含足够着染 10 张载玻片的材料。
SignalStar 符号

目录

1 介绍：SignalStar™ 染色方法

SignalStar 多重免疫组织化学 (mIHC) 是一种采用抗体、寡核苷酸 (oligos) 和荧光团探究细胞存在情况、位置、功能和生物标记物共表达模式的技术。SignalStar 技术使得在维持空间背景和组织结构的同时检测多个表型靶标与功能靶标成为可能。洞悉这些对了解细胞如何组织并相互作用以影响组织微环境及推动疾病进展和对治疗作出反应至关重要。

SignalStar 系统的力量存在于 SignalStar 抗体设计中。这些抗体已就用于福尔马林固定、石蜡包埋 (FFPE) 的组织中经过严格验证，并且随后使用位点特异性偶联和彻底纯化方法偶联至唯一寡核苷酸标签。使用高度特异的互补性寡核苷酸和荧光团网络，科学家可以放大 3-8 种靶标的信号，即使这些靶标处于低丰度亦如此。

SignalStar Multiplex IHC 工作流程图

图 1. 将您所选像素尺寸（最多 3-8 种唯一寡核苷酸偶联抗体）下的所有抗体按混合物添加于一个初级孵育步骤中。带荧光染料（信道：488、594、647 和 750）的互补性寡核苷酸通过构造与抗体接合的寡核苷酸-荧光团结构体，在第一轮成像中放大多达 4 种寡核苷酸偶联抗体的信号。如果像素尺寸大于 4，则柔和移除第一轮的寡核苷酸和荧光团，并且进行第二轮放大以可视化多达 4 种额外的寡核苷酸偶联抗体；互补性寡核苷酸系统和使用荧光团移除过程使得从同一底物放大第二轮抗体成为可能，同时无交叉反应性。然后将 2 幅图像用专有或开源软件以计算方式对齐并融合，以生成由多达 8 种靶标组成的图像。

2 溶液和试剂

2.1 包含的试剂盒组分

试剂盒中包含的材料
多达 8 种 SignalStar 寡核苷酸偶联抗体（见下文）
多达 8 种 SignalStar 互补性寡核苷酸（见下文）
SignalStar™ Antibody Diluent A
SignalStar™ Antibody Diluent B
SignalStar™ Amplification Buffer A
SignalStar™ Amplification Buffer B
SignalStar™ Amplification Oligo Set A:
 488
 594
 647
 750
SignalStar™ Amplification Oligo Set B:
 488
 594
 647
 750
SignalStar™ Ligation Buffer
T4 DNA 连接酶 (5 U/µL)
ATP (100 mM)
10X dsDNase Buffer
dsDNase
 

包括多达 8 种 SignalStar 寡核苷酸偶联抗体 (A) 和多达 8 种 SignalStar 互补性寡核苷酸 (B)，它们在订购时选定并随各自寡核苷酸-抗体对 (C) 成套提供。请参见以下示例。

SignalStar 寡核苷酸抗体

2.2 不包括所要求的试剂

  • Tris Buffered Saline with Tween 20 (TBST-10X) #9997
  • DAPI #4083
  • ProLong Gold Antifade Reagent #9071
  • Nuclease-free Water #12931
  • 10% 中性缓冲福尔马林
  • 低留置移液器吸头

2.3 不含所需的试剂 - 可从 Leica Biosystems 获得

  • BOND 研究检测系统 #DS9455
  • BOND 抽吸探针清洁套件 #CS9100
  • BOND 滴定试剂盒（10 个容器，50 根插管）#OPT9049
  • BOND 开式容器 30 mL（10 包）#OP309700
  • BOND 开式容器 7 mL（10 包）#OP79193
  • BOND 通用覆盖物（160 包）#S21.4611
  • BOND TM 表位修复 2-1 L (RTU) #AR9640
  • BOND Dewax Solution 1 L (RTU) #AR9222
  • BOND Wash Solution 10X 浓缩物，1L #AR9590

3 开始之前的重要考虑事项

警告

请勿合并相同荧光信道的互补性寡核苷酸。 对于每个荧光信道，成像轮次可以含有仅 1 种互补性性寡核苷酸。切勿在相同成像轮次合并专属于相同荧光信道的互补性寡核苷酸，因为这会使分析结果不可解读。
 
警告

切勿合并来自不同检验组合的抗体。 如果您同时运行多个检验组合，则必须为每个检验组合生成单独的抗体/互补性寡核苷酸混合物。
注意：

在创建您的解决方案之前，使用 BOND RX 软件设置实验步骤和试剂。 创建容器、实验步骤和新的 BOND 研究检测系统。要求 BOND 研究检测系统运行此实验步骤。
注意：

执行每轮 SignalStar 检测后，始终在 BOND RX 上进行吸液探针清洁。
注意：

请确认您的 SignalStar 检验组合设计是否要求 2 轮成像。 利用本文档第 10.1 节和第 9.1 节中的 SignalStar 检验组合设计示例和 SignalStar 检验组合设计工作表，获取指导和帮助。
注意：

确认您的显微镜可以检测此试剂盒中提供的荧光团。 成像时，除 DAPI 外，还存在 4 个需要采集的荧光信道。
 
荧光通道 激发光波长 (nm) 发射光波长 (nm) 激光线 通用滤光器
488 488 520 488 FITC
594 590 618 561/594 Texas Red
647 650 668 594/633 Cy®5
750 752 776 633 Cy®7
注

建议应通过将单张染色的载玻片对上述光谱成像，创建光谱库。 这将使得更好解混成为可能，以帮助最大限度降低光谱交叉干扰的可能性。
注

建议使用 DAPI 浓缩物，而不是含 DAPI 的封固剂。 DAPI 亮染便利更好地对齐图像。
注意：

如果溶液未充分混合，荧光信号可能变动不定或减弱。 使用前，将每种试剂按 1,000 rpm 离心 30 秒，然后通过抽吸缓慢混合。 使用试剂时，缓慢移液以确保准确度。不使用时，所有 SignalStar 试剂盒组分均储存于冰上。一旦已经合并所有试剂用于运行后，应迅速使用 SignalStar 溶液。
注意：

最佳地，载玻片应在完成染色的 8 小时以内成像。 如果载玻片未在这个时间段以内成像，则荧光信号可能减弱。
注

如果对本实验步骤有任何偏离，则不保证结果。 SignalStar 实验步骤用指定的抗原修复步骤和染色步骤开发并优化。
注

建议使用阳性对照载玻片。 每次运行中应纳入一种组织，其中生色性染色已经对该组织确认多重检验组合中存在所有靶标。
注

建议应按 1:100 使用每种抗体。 但是，供应了足以按 1:50 或 1:200 稀释度使用的抗体试剂。

4 BOND RX 自动染色机设置

注意：

在创建您的解决方案之前，使用 BOND RX 软件设置实验步骤和试剂。需要 BOND RX 软件 7.0 版或更高版本。

4.1 BOND RX 自动染色机上的新试剂创建

必须依赖 BOND RX 软件创建以下试剂用于 SignalStar 分析：

BOND 滴定容器

 

1. MARKER（= SignalStar 染色溶液）
 

2. SignalStar Amplification Solution 1
 

3. SignalStar Amplification Solution 2
 

4. SignalStar Ligation Solution
 

5. SignalStar Fluorescent Removal Solution

BOND 7 mL 开式容器

 

6. 10% 中性缓冲福尔马林
注意：

创建 10% 中性缓冲福尔马林试剂时选择“危险”，以确保妥善处置废物。

BOND 30 mL 开式容器

 

7. 0.1X TBST
 

8. 1X TBST（连接于 BOND 研究检测系统所需）

4.2 BOND 研究检测系统设置

 

1. 创建一个名为“CST SignalStar”的新 BOND 研究检测系统。
 

2. 将含 1X TBST 的 30 mL 开式容器连接至 CST SignalStar BOND 研究检测系统。
注意：

步骤 2 中开式容器必须明确命名（例如，“1X TBST”而不是“0.1X TBST”）。

4.3 针对 SignalStar 第 1 轮成像和第 2 轮成像创建 BOND RX 实验步骤

 

1. 在 BOND RX 软件中，选择“实验步骤设置”选项卡。
 

2. 选择“*IF 实验步骤”（确保 Leica 列于 “修改者”栏中）。
 

3. 复制实验步骤并将其重命名为“CST SignalStar 第 1 轮成像”。添加缩写名称“CST Rd1”。
 

4. 选择“显示洗涤步骤”。
 
5. 
 		 删除所有步骤，并添加在这份文档中标题为“BOND RX 实验步骤设置清单：第 1 轮成像”的第 9.2 节存在的步骤。

 
 

6. 选择“CST SignalStar”作为首选的检测系统。
 

7. 选择“创建实验步骤”。
 

8. 单击“保存”，然后单击“是”以确认警告消息。
 

9. 创建“CST SignalStar 第 1 轮成像”实验步骤的副本。
 

10. 将副本名称更改为“CST SignalStar 第 2 轮成像”，缩写名称为“CST Rd2”。
 

11. 选择“显示洗涤步骤”。
 
12. 
 		 删除步骤 1-11，并添加如这份文档中标题为“BOND RX 实验步骤设置清单：成像轮次”的第 9.3 节内所列的步骤 1-10 。
 

13. 选择“CST SignalStar”作为首选的检测系统。
 

14. 选择“创建实验步骤”。
 

15. 单击“保存”，然后单击“是”以确认警告消息。

5 SignalStar 第 1 轮成像：溶液配制

警告

必须在适当的 BOND RX 容器中或来自 BOND 滴定套件 (#OPT9049) 的插管中使用每种试剂，以便该分析正常运行。 请参阅下表，以了解在 BOND RX 自动染色机上执行 SignalStar 分析所需的容器或插管的数目。
警告

请勿过度填充开式容器。如果容器过度填充，BOND RX 自动染色机将认为容器是“空的”。

 

试剂
BOND 容器		 所需容器的数目
5 块载玻片 10 块载玻片
SignalStar Imaging Round 1 Solution BOND 6 mL 滴定插管 1 1
SignalStar Amplification Solution 1 BOND 6 mL 滴定插管 1 2
SignalStar Amplification Solution 2 BOND 6 mL 滴定插管 1 2
SignalStar Ligation Solution BOND 6 mL 滴定插管 1 1
10% 中性缓冲福尔马林 BOND 7 mL 开式容器 1 1
0.1X TBST 溶液 BOND 30 mL 开式容器 2 3
1X TBST 溶液 BOND 30 mL 开式容器 1 1

5.1 第 1 轮成像：SignalStar 溶液

注意：

一旦配制，SignalStar Imaging Round 1 Solution 应含有（随试剂盒订购的多达 8 种）所有抗体（包括用于第 1 轮成像和第 2 轮成像的那些抗体）和用于第 1 轮成像的互补性寡核苷酸。利用本文档第 10.1 节和第 9.1 节中的 SignalStar 检验组合设计示例和 SignalStar 检验组合设计工作表，获取指导和帮助。
警告

请勿合并相同荧光信道的互补性寡核苷酸。
注意：

使用低留置移液器吸头配制溶液并在室温颠倒转动 20 分钟。缓慢移液入 BOND 6 mL 滴定插管，以确保准确度并避免产生任何气泡。配制溶液时，所有 SignalStar 试剂盒组分均储存于冰上。一旦已经合并所有试剂用于运行，应迅速使用 SignalStar 溶液。

 

试剂盒组分		 所需体积
5 张载玻片 (µL) 10 张载玻片 (µL)
SignalStar Antibody Diluent A 770 1,295
SignalStar Antibody Diluent B 330 555
SignalStar 寡核苷酸偶联抗体 1 11 18.5
SignalStar 寡核苷酸偶联抗体 2 11 18.5
SignalStar 寡核苷酸偶联抗体 3 11 18.5
SignalStar 寡核苷酸偶联抗体 4（如需要） 11 18.5
SignalStar 寡核苷酸偶联抗体 5（如需要） 11 18.5
SignalStar 寡核苷酸偶联抗体 6（如需要） 11 18.5
SignalStar 寡核苷酸偶联抗体 7（如需要） 11 18.5
SignalStar 寡核苷酸偶联抗体 8（如需要） 11 18.5
第 1 轮成像：SignalStar 互补性寡核苷酸 1 11 18.5
第 1 轮成像：SignalStar 互补性寡核苷酸 2 11 18.5
第 1 轮成像：SignalStar 互补性寡核苷酸 3 11 18.5
第 1 轮成像：SignalStar 互补性寡核苷酸 4（如需要） 11 18.5
总体积 1,232 2,072

5.2 第 1 轮成像：SignalStar Amplification Solution 1

注意：

使用低留置移液器吸头配制溶液并在室温颠倒转动 20 分钟。缓慢移液入 BOND 6 mL 滴定插管，以确保准确度并避免产生任何气泡。配制溶液时，所有 SignalStar 试剂盒组分均储存于冰上。一旦已经合并所有试剂用于运行后，应迅速使用 SignalStar 溶液。

注意：

对于 10 张载玻片运行，在锥形管中补充总体积，转动 20 分钟，然后在 2 个滴定插管之间均匀分配。
 

试剂盒组分		 所需体积
5 张载玻片 (µL) 10 张载玻片 (µL)
SignalStar Amplification Buffer A 2,425 4,675
SignalStar Amplification Buffer B 2,425 4,675
SignalStar Amplification Oligo A-488 48.5 93.5
SignalStar Amplification Oligo A-594 48.5 93.5
SignalStar Amplification Oligo A-647 48.5 93.5
SignalStar Amplification Oligo A-750 48.5 93.5
总体积 5,044 9,724

5.3 第 1 轮成像：SignalStar Amplification Solution 2

注意：

使用低留置移液器吸头配制溶液并在室温颠倒转动 20 分钟。缓慢移液入 BOND 6 mL 滴定插管，以确保准确度并避免产生任何气泡。配制溶液时，所有 SignalStar 试剂盒组分均储存于冰上。一旦已经合并所有试剂用于运行后，应迅速使用 SignalStar 溶液。

注意：

对于 10 张载玻片运行，在锥形管中补充总体积，转动 20 分钟，然后在 2 个滴定插管之间均匀分配。
 

试剂盒组分		 所需体积
5 张载玻片 (µL) 10 张载玻片 (µL)
SignalStar Amplification Buffer A 2,425 4,675
SignalStar Amplification Buffer B 2,425 4,675
SignalStar Amplification Oligo B-488 48.5 93.5
SignalStar Amplification Oligo B-594 48.5 93.5
SignalStar Amplification Oligo B-647 48.5 93.5
SignalStar Amplification Oligo B-750 48.5 93.5
总体积 5,044 9,724

5.4 第 1 轮成像：SignalStar Ligation Solution

注意：

将以下试剂合并于一个 BOND 滴定插管中。用封口膜覆盖并涡旋混合 10 秒。配制溶液时，所有 SignalStar 试剂盒组分均储存于冰上。一旦已经合并所有试剂用于运行后，应迅速使用 SignalStar 溶液。

 

试剂盒组分/试剂		 所需体积
5 张载玻片 (µL) 10 张载玻片 (µL)
SignalStar 连接缓冲液 550 925
Nuclease-free Water #12931 517 869.5
T4 DNA 连接酶 (5 U/µL) 22 37
ATP (100 mM) 11 18.5
总体积 1,100 1,850

5.5 不包括额外的所需溶液

 
  • 0.1X Tris Buffered Saline with Tween 20 (TBST)： 要配制 500 mL 1X TBST，将 5 mL Tris Buffered Saline with Tween 20 (TBST-10X) #9997 添加至 495 ml dH2O 。填充 30 mL BOND 开式容器（2 个容器用于 5 张载玻片，3 个容器用于 10 张载玻片）。避免配制期间生成气泡。
  • 1X Tris Buffered Saline with Tween 20 (TBST)： 要配制 500 mL 1X TBST，将 50 mL Tris Buffered Saline with Tween 20 (TBST-10X) #9997 添加至 450 ml dH2O 。填充 30 mL BOND 开式容器（1 个容器用于 5 张或 10 张载玻片）。避免配制期间生成气泡。
  • 10% 中性缓冲福尔马林：在实验室通风橱中，填充 7 mL BOND 开式容器。

6 SignalStar 第 1 轮成像：使用的 BOND RX 实验步骤

6.1 载玻片焙烘

注

可以在您开始实验前当天焙烘载玻片。这个步骤允许固体石腊熔化。
  1. 将载玻片在 60°C 孵育 30 分钟。

6.2 运行 BOND RX 实验步骤

  2. 在 BOND RX 软件中，创建研究并添加载玻片。
  3. “添加载玻片”时，使用以下选项在 BOND 上制备组织：
  1. 载玻片准备：脱蜡
  2. 分配量：150 µL
  3. HIER：ER2 40 分钟
  4. 选择“SignalStar 第 1 轮成像”作为实验步骤并选择“HIER ER2 40 分钟”用于每块载玻片。
  5. 打印标签，贴在载玻片上，并将载玻片添加到 BOND 载玻片托盘。
  6. 将 BOND 覆盖物置于在载玻片上，确保载玻片正确位于托盘中。
注意：

良好做法是确认第 1 轮成像实验步骤中每个步骤都正确无误。 请使用第 9.2 节中的清单协助创建您的实验步骤。
注意：

确保下面列出的选定 0.1X TBST 洗涤设置为“打开”。 如果洗涤未“打开”，则荧光信号可能变动不定或减弱。确认总共有 6 个 SignalStar Amplification Solution 1 步骤和 6 个 SignalStar Amplification Solution 2 步骤。
注意：

确认散装 Bond 洗涤液容器为满，且废物容器为空。
  7. 启动 BOND RX 运行。
警告

立即启动 BOND RX 染色运行，请勿使用延迟启动。一旦染色完成，则载玻片可以搁在 BOND RX 自动染色机上过夜。
  8. 从 BOND RX 自动染色机中取出载玻片并置入 0.1X TBST。
  9. 在 BOND RX 自动染色机上运行抽吸探针清洁。按照常规程序清洁覆盖物。
  10. 根据数据表说明，配制 DAPI #4083 溶液。
  11. 用 DAPI 溶液复染。
  12. 将载玻片浸没于 0.1X TBST 中 30 秒。
  13. 将载玻片用 ProLong Gold Antifade Reagent #9071 封装。
  14. 在 8 小时以内对载玻片成像。
注意：

一旦载玻片脱蜡或取下盖玻片，任何时候切勿让载玻片干透。

7 SignalStar 第 2 轮成像：溶液配制

警告

必须在适当的 BOND RX 容器中或来自 BOND 滴定套件 (#OPT9049) 的插管中使用每种试剂，以便分析正常运行。 请参阅下表，以了解在 BOND RX 自动染色机上执行 SignalStar 分析所需的容器或插管的数目。
警告

请勿过度填充开式容器。如果容器过度填充，BOND RX 自动染色机将认为容器是“空的”。

 

试剂
BOND 容器		 所需容器的数目
5 块载玻片 10 块载玻片
SignalStar Imaging Round 2 Solution BOND 6 mL 滴定插管 1 1
SignalStar Amplification Solution 1 BOND 6 mL 滴定插管 1 2
SignalStar Amplification Solution 2 BOND 6 mL 滴定插管 1 2
SignalStar Ligation Solution BOND 6 mL 滴定插管 1 1
10% 中性缓冲福尔马林 BOND 7 mL 开式容器 1 1
0.1X TBST 溶液 BOND 30 mL 开式容器 2 3
1X TBST 溶液 BOND 30 mL 开式容器 1 1
SignalStar Fluorescent Removal Solution BOND 6 mL 滴定插管 1 1

7.1 第 2 轮成像：SignalStar 溶液

注意：

一旦配制，SignalStar Imaging 2 Solution 应仅含用于第 2 轮成像的互补性寡核苷酸。利用本文档第 10.1 节和第 9.1 节中的 SignalStar 检验组合设计示例和 SignalStar 检验组合设计工作表，获取指导和帮助。
警告

请勿合并相同荧光信道的互补性寡核苷酸。
注意：

使用低留置移液器吸头配制溶液并在室温颠倒转动 20 分钟。缓慢移液入 BOND 6 mL 滴定插管，以确保准确度并避免产生任何气泡。配制溶液时，所有 SignalStar 试剂盒组分均储存于冰上。一旦已经合并所有试剂用于运行后，应迅速使用 SignalStar 溶液。
 

试剂盒组分		 所需体积
5 张载玻片 (µL) 10 张载玻片 (µL)
SignalStar Antibody Diluent A 770 1,295
SignalStar Antibody Diluent B 330 555
第 2 轮成像：SignalStar 互补性寡核苷酸 5 11 18.5
第 2 轮成像：SignalStar 互补性寡核苷酸 6（如需要） 11 18.5
第 2 轮成像：SignalStar 互补性寡核苷酸 7（如需要） 11 18.5
第 2 轮成像：SignalStar 互补性寡核苷酸 8（如需要） 11 18.5
总体积 1,144 1,924

7.2 第 2 轮成像：SignalStar Amplification Solution 1

注意：

使用低留置移液器吸头配制溶液并在室温颠倒转动 20 分钟。缓慢移液入 BOND 6 mL 滴定插管，以确保准确度并避免产生任何气泡。配制溶液时，所有 SignalStar 试剂盒组分均储存于冰上。一旦已经合并所有试剂用于运行后，应迅速使用 SignalStar 溶液。

注意：

对于 10 张载玻片运行，在锥形管中补充总体积，转动 20 分钟，然后在 2 个滴定插管之间均匀分配。

 

试剂盒组分		 所需体积
5 张载玻片 (µL) 10 张载玻片 (µL)
SignalStar Amplification Buffer A 2,425 4,675
SignalStar Amplification Buffer B 2,425 4,675
SignalStar Amplification Oligo A-488 48.5 93.5
SignalStar Amplification Oligo A-594 48.5 93.5
SignalStar Amplification Oligo A-647 48.5 93.5
SignalStar Amplification Oligo A-750 48.5 93.5
总体积 5,044 9,724

7.3 第 2 轮成像：SignalStar Amplification Solution 2

注意：

使用低留置移液器吸头配制溶液并在室温颠倒转动 20 分钟。缓慢移液入 BOND 6 mL 滴定插管，以确保准确度并避免产生任何气泡。配制溶液时，所有 SignalStar 试剂盒组分均储存于冰上。一旦已经合并所有试剂用于运行后，应迅速使用 SignalStar 溶液。

注意：

对于 10 张载玻片运行，在锥形管中补充总体积，转动 20 分钟，然后在 2 个滴定插管之间均匀分配。

 

试剂盒组分		 所需体积
5 张载玻片 (µL) 10 张载玻片 (µL)
SignalStar Amplification Buffer A 2,425 4,675
SignalStar Amplification Buffer B 2,425 4,675
SignalStar Amplification Oligo B-488 48.5 93.5
SignalStar Amplification Oligo B-594 48.5 93.5
SignalStar Amplification Oligo B-647 48.5 93.5
SignalStar Amplification Oligo B-750 48.5 93.5
总体积 5,044 9,724

7.4 第 2 轮成像：SignalStar Ligation Solution

注意：

在 1 个 BOND 滴定插管中合并以下试剂。用封口膜覆盖并涡旋混合 10 秒。配制溶液时，所有 SignalStar 试剂盒组分均储存于冰上。一旦已经合并所有试剂用于运行后，应迅速使用 SignalStar 溶液。

 

试剂盒组分/试剂		 所需体积
5 张载玻片 (µL) 10 张载玻片 (µL)
SignalStar 连接缓冲液 550 925
Nuclease-free Water #12931 517 869.5
T4 DNA 连接酶 (5 U/µL) 22 37
ATP (100 mM) 11 18.5
总体积 1,100 1,850

7.5 第 2 轮成像：SignalStar Fluorescent Removal Solution

注意：

在 1 个 BOND 滴定插管中合并以下试剂。用封口膜覆盖并涡旋混合 10 秒。配制溶液时，所有 SignalStar 试剂盒组分均储存于冰上。一旦合并所有试剂合用于运行，应立即迅速 SignalStar 溶液。
 

试剂盒组分/试剂		 所需体积
5 张载玻片 (µL) 10 张载玻片 (µL)
10X dsDNase Buffer 185 335
dsDNase 18.5 33.5
Nuclease-free Water #12931 1,646.5 2,981.5
总体积 1,850 3,350

7.6 不包括额外的所需溶液

 
  • 0.1X Tris Buffered Saline with Tween 20 (TBST)： 要配制 500 mL 1X TBST，将 5 mL Tris Buffered Saline with Tween 20 (TBST-10X) #9997 添加至 495 ml dH2O 。填充 30 mL BOND 开式容器（2 个容器用于 5 张载玻片，3 个容器用于 10 张载玻片）。避免配制期间生成气泡。
  • 1X Tris Buffered Saline with Tween 20 (TBST)： 要配制 500 mL 1X TBST，将 50 mL Tris Buffered Saline with Tween 20 (TBST-10X) #9997 添加至 450 ml dH2O 。填充 30 mL BOND 开式容器（1 个容器用于 5 张或 10 张载玻片）。避免配制期间生成气泡。
  • 10% 中性缓冲福尔马林：在实验室通风橱中，填充 7 mL BOND 开式容器。

8 SignalStar 第 2 轮成像：使用的 BOND RX 实验步骤

  1. 采集 SignalStar 第 1 轮成像的图像后，将载玻片浸泡于 dH2O 中 >30 分钟，以轻柔取下盖玻片。
注意：

一旦载玻片脱蜡或取下盖玻片，任何时候切勿让载玻片干透。
  2. 在 BOND RX 软件中，创建研究并添加载玻片。
  3. “添加载玻片”时，使用以下选项在 BOND 上制备组织：
  1. 载玻片准备：--（无数值/不需要）
  2. 分配量：150 µL
  3. HIER：--（无数值/不需要）
  4. 选择“CST SignalStar 第 2 轮成像”，确保将载玻片准备选为“--”并且将 HIER 选为“--”。
  5. 打印标签，向载玻片添加标签，并将载玻片置于 BOND 载玻片托盘上。
  6. 在添加 BOND 覆盖物之前，将 2-3 滴 dH2O 滴到每块载玻片上。
警告

重要事项：第 2 轮放大无需脱蜡和 HIER（抗原修复）。如果使用脱蜡和 HIER，则第 2 轮放大结果将不可解读。

注意：

良好做法是确认第 2 轮成像实验步骤中每个步骤正确。 请使用第 9.3 节中的清单协助创建您的实验步骤。
注意：

确保下面所列的选定 0.1X TBST 洗涤设置为“打开”。如果洗涤未“打开”，则荧光信号可能变动不定或减弱。确认总共有 6 个 SignalStar Amplification Solution 1 步骤和 6 个 SignalStar Amplification Solution 2 步骤。
注意：

确认散装 Bond 洗涤液容器为满，且废物容器为空。
  7. 启动 BOND RX 运行。
警告

立即启动 BOND RX 染色运行，请勿使用延迟启动。一旦染色完成，则载玻片可以搁在 BOND RX 自动染色机上过夜。
  8. 从 BOND RX 自动染色机中取出载玻片并置入 0.1X TBST。
  9. 在 BOND RX 自动染色机上运行抽吸探针清洁。按照常规程序清洁覆盖物。
  10. 根据数据表说明，配制 DAPI #4083 溶液。
  11. 用 DAPI 溶液复染。
  12. 将载玻片浸没于 0.1X TBST 中 30 秒。
  13. 将载玻片用 ProLong Gold Antifade Reagent #9071 封装。
  14. 在 8 小时以内对载玻片成像。
注意：

一旦载玻片脱蜡或取下盖玻片，任何时候切勿让载玻片干透。

9 用户工作表

9.1 SignalStar 检验组合设计工作表

寡核苷酸偶联抗体 互补性寡核苷酸 产品对编号 。 488 594 647 750
               
               
               
               
               
               
               
               

（参见附录 10.1，了解检验组合设计示例）

9.2 BOND RX 实验步骤设置清单：第 1 轮成像

BOND 步骤 ✓ 试剂 步骤类型 孵育时间（分钟） 温度 (C) 分配类型
1 ☐ *去离子水 洗涤 0:00 环境 150 µL
2 ☐ *去离子水 洗涤 0:00 环境 打开
3 ☐ *去离子水 洗涤 0:00 环境 150 µL
4 ☐ 0.1X TBST 溶液 洗涤 0:00 环境 150 µL
5 ☐ MARKER（SignalStar Imaging Round 1 Solution） 主要 40:00 环境 150 µL
6 ☐ 1X TBST 溶液 试剂 5:00 环境 打开
7 ☐ 0.1X TBST 溶液 试剂 5:00 环境 150 µL
8 ☐ 10% 中性缓冲福尔马林 试剂 5:00 环境 150 µL
9 ☐ *去离子水 洗涤 0:00 环境 打开
10 ☐ *去离子水 洗涤 0:00 环境 打开
11 ☐ *去离子水 洗涤 0:00 环境 150 µL
12 ☐ 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
13 ☐ SignalStar Amplification Solution 1 试剂 8:00 环境 150 µL
14 ☐ 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
15 ☐ 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
16 ☐ 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
17 ☐ SignalStar Amplification Solution 2 试剂 16:00 环境 150 µL
18 ☐ 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
19 ☐ 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
20 ☐ 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
21 ☐ SignalStar Amplification Solution 1 试剂 8:00 环境 150 µL
22 ☐ 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
23 ☐ 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
24 ☐ 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
25 ☐ SignalStar Amplification Solution 2 试剂 16:00 环境 150 µL
26 ☐ 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
27 ☐ 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
28 ☐ 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
29 ☐ SignalStar Amplification Solution 1 试剂 8:00 环境 150 µL
30 ☐ 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
31 ☐ 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
32 ☐ 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
33 ☐ SignalStar Amplification Solution 2 试剂 16:00 环境 150 µL
34 ☐ 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
35 ☐ 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
36 ☐ 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
37 ☐ SignalStar Amplification Solution 1 试剂 8:00 环境 150 µL
38 ☐ 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
39 ☐ 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
40 ☐ 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
41 ☐ SignalStar Amplification Solution 2 试剂 16:00 环境 150 µL
42 ☐ 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
43 ☐ 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
44 ☐ 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
45 ☐ SignalStar Amplification Solution 1 试剂 8:00 环境 150 µL
46 ☐ 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
47 ☐ 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
48 ☐ 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
49 ☐ SignalStar Amplification Solution 2 试剂 16:00 环境 150 µL
50 ☐ 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
51 ☐ 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
52 ☐ 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
53 ☐ SignalStar Amplification Solution 1 试剂 8:00 环境 150 µL
54 ☐ 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
55 ☐ 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
56 ☐ 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
57 ☐ SignalStar Amplification Solution 2 试剂 16:00 环境 150 µL
58 ☐ 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
59 ☐ 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
60 ☐ 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
61 ☐ SignalStar Ligation Solution 试剂 20:00 环境 150 µL
62 ☐ 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
63 ☐ 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
64 ☐ 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
65 ☐ 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
66 ☐ BOND 洗涤液 洗涤 0:00 环境 150 µL

9.3 BOND RX 实验步骤设置清单：第 2 轮成像

BOND 步骤 ✓ 试剂 步骤类型 孵育时间（分钟） 温度 (C) 分配类型
1 ☐ 0.1X TBST 溶液 洗涤 0:00 环境 打开
2 ☐ 0.1X TBST 溶液 洗涤 0:00 环境 打开
3 ☐ SignalStar Stripping Buffer 试剂 60:00 37° 150 µL
4 ☐ SignalStar Stripping Buffer 试剂 60:00 37° 150 µL
5 ☐ *去离子水 洗涤 0:00 环境 打开
6 ☐ *去离子水 洗涤 0:00 环境 打开
7 ☐ *去离子水 洗涤 0:00 环境 打开
8 ☐ MARKER (SignalStar Imaging Round 2 Solution) 主要 40:00 环境 150 µL
9 ☐ 1X TBST 溶液 试剂 5:00 环境 打开
10 ☐ 0.1X TBST 溶液 试剂 5:00 环境 打开
11 ☐ 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
12 ☐ SignalStar Amplification Solution 1 试剂 8:00 环境 150 µL
13 ☐ 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
14 ☐ 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
15 ☐ 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
16 ☐ SignalStar Amplification Solution 2 试剂 16:00 环境 150 µL
17 ☐ 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
18 ☐ 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
19 ☐ 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
20 ☐ SignalStar Amplification Solution 1 试剂 8:00 环境 150 µL
21 ☐ 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
22 ☐ 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
23 ☐ 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
24 ☐ SignalStar Amplification Solution 2 试剂 16:00 环境 150 µL
25 ☐ 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
26 ☐ 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
27 ☐ 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
28 ☐ SignalStar Amplification Solution 1 试剂 8:00 环境 150 µL
29 ☐ 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
30 ☐ 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
31 ☐ 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
32 ☐ SignalStar Amplification Solution 2 试剂 16:00 环境 150 µL
33 ☐ 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
34 ☐ 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
35 ☐ 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
36 ☐ SignalStar Amplification Solution 1 试剂 8:00 环境 150 µL
37 ☐ 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
38 ☐ 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
39 ☐ 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
40 ☐ SignalStar Amplification Solution 2 试剂 16:00 环境 150 µL
41 ☐ 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
42 ☐ 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
43 ☐ 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
44 ☐ SignalStar Amplification Solution 1 试剂 8:00 环境 150 µL
45 ☐ 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
46 ☐ 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
47 ☐ 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
48 ☐ SignalStar Amplification Solution 2 试剂 16:00 环境 150 µL
49 ☐ 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
50 ☐ 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
51 ☐ 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
52 ☐ SignalStar Amplification Solution 1 试剂 8:00 环境 150 µL
53 ☐ 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
54 ☐ 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
55 ☐ 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
56 ☐ SignalStar Amplification Solution 2 试剂 16:00 环境 150 µL
57 ☐ 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
58 ☐ 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
59 ☐ 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
60 ☐ SignalStar Ligation Solution 试剂 20:00 环境 150 µL
61 ☐ 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
62 ☐ 0.1X TBST 溶液 试剂 0:00 环境 打开
63   BOND 洗涤液 洗涤 0:00 环境 150 µL

10 附录

10.1 SignalStar 检验组合设计示例

寡核苷酸偶联抗体 互补性寡核苷酸 产品对编号 。 488 594 647 750
PD-1 (Intracellular Domain) (D4W2J)
XP® Rabbit mAb
(SignalStar™ Conjugate 0008)		 互补性寡核苷酸
(CO-0008-488)		 17942 1 ●      
PD-L1 (E1L3N®) XP® Rabbit mAb
(SignalStar™ Conjugate 0005)		 互补性寡核苷酸
(CO-0005-594)		 28249 1   ●    
TIM-3 (D5D5R™) XP® Rabbit mAb
(SignalStar™ Conjugate 0010)		 互补性寡核苷酸
(CO-0010-647)		 15231 1     ●  
Ki-67 (8D5) Mouse mAb
(SignalStar™ Conjugate 0014)		 互补性寡核苷酸
(CO-0014-750)		 56398 1       ●
CD8ɑ (D8A8Y) Rabbit mAb
(SignalStar™ Conjugate 0004)		 互补性寡核苷酸
(CO-0004-488)		 45747 2 ●      
CD68 (D4B9C) XP® Rabbit mAb
(SignalStar™ Conjugate 0007)		 互补性寡核苷酸
(CO-0007-594)		 77318 2   ●    
CD20 (E7B7T) XP® Rabbit mAb
(SignalStar™ Conjugate 0011)		 互补性寡核苷酸
(CO-0011-647)		 36775 2     ●  
Pan-Keratin (C11) Mouse mAb
(SignalStar™ Conjugate 0003)		 互补性寡核苷酸
(CO-0003-750)		 97227 2       ●

10.2 故障排除和常见问题

如何验证 SignalStar Multiplex IHC 试剂盒和试剂？

CST 彻底验证了 SignalStar Multiplex IHC Panel Builder 菜单中可提供的每种抗体。通过滴定和荧光团配对以及在两轮成像中测试抗体的各种组合。对各种肿瘤和组织类型进行测试。我们还严格测试了传统显色测定法中使用的亲本抗体，因这些抗体充当这种荧光测定法的基础。

该测定法是否对冷冻组织有效？

尚未验证 SignalStar Multiplex IHC 试剂盒与试剂可用于冷冻的组织。我们正在验证我们的抗体和实验步骤是否可用于新鲜组织或冷冻的组织。

你们是否有抗小鼠抗体可提供？

尚未验证 SignalStar Multiplex IHC 试剂盒和试剂可用于小鼠组织。我们正在验证小鼠反应性抗体。

我在你们的可提供抗体菜单中没看到我的目的靶标。我还能以某种方式在我的检测板中使用它吗？

尚未验证 SignalStar Multiplex IHC 试剂盒和试剂可配合我公司菜单以外的抗体使用。我们正在开发诸多定制解决方案以便在 SignalStar Multiplex IHC 测定法中使用您的自有抗体。

我能否将此检测中使用的抗体与直接偶联物组合？

尚未验证 SignalStar Multiplex IHC 试剂盒和试剂可与直接偶联物联合使用。有可能将直接偶联物并入您的实验步骤。然而，由于 SignalStar 试剂受益于荧光信号放大，因此可能存在光谱渗出，后者因使用偶联物未放大的测定法产生。

将我的 SignalStar 染色与系列切片上的生色性染色比较时，我看到更多阳性细胞。我如何知道这种过度染色是否正确？

在优化期间，我们发现荧光染色可能显示比显色性染色更高的阳性百分比。为确保任何过度染色为特异性，请确认用其他染色剂证明亚细胞定位和共定位正确。例如，如果所有 CD8＋ 细胞都为 CD3＋，则任何与显色性染色相比的 CD8＋过度染色很可能是正确的。

完成染色后我可能等多久才对切片成像？

对于第 1 轮成像，在完成染色后 8 小时内成像时，染色应显示稳定信号。对于第 2 轮成像，成像应尽可能接近于染色完成时进行，但是应当保持稳定长达 8 小时。

我是否需要针对自己正在使用的组织类型优化 SignalStar Multiplex IHC 试剂盒和试剂？

SignalStar Multiplex IHC 试剂盒和试剂已针对抗体的荧光团配对和顺序作了优化。由于组织在靶标的质量和表达水平方面不同，将您的检验组合中抗体的浓度升高 2 倍或降低 0.5 倍可能有助在您的实验中实现最佳信号。

该测定法中应包括哪种适当的阳性对照？是否需要多个对照？

通过显色性 IHC 证明每个靶标呈阳性的任何组织都可以充当阳性对照组织。因此，每个靶标都将要求阳性对照，这有时可能导致多个对照必不可少。为了最佳比较，各切片应尽可能连续。

仅供研究使用。不得用于诊断流程。

Cell Signaling Technology、XP 和 SignalStar 均是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。
E1L3N 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的注册商标。Cy 和 CyDye 是 GE Healthcare 的注册商标。所有其他商标均属各自所有者专有。访问我们的商标信息页面。
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发布​时间 2023 年 7 月

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