Cell Signaling ^® SignalStar^™ 多重免疫组织化学分析手册

产品信息：

储存：所有试剂盒组分都储存于 -20ºC。

稳定性：在建议的温度保存时，该试剂盒中所有组分均稳定至少 12 个月。不得超过 5 次冻/融循环。

应用：SignalStar 试剂盒适用于进行荧光多重免疫组织化学分析。

载玻片数目：该试剂盒包含足够着染 10 张载玻片的材料。

1 介绍：SignalStar™ 染色方法
2 溶液和试剂
- 2.1 包含的试剂盒组分
- 2.2 不包括所需的试剂
3 开始之前的重要考虑事项
4 SignalStar 第 1 轮成像：溶液配制
5 SignalStar 第 1 轮成像：使用的实验步骤
6 SignalStar 第 2 轮成像：溶液配制
7 SignalStar 第 2 轮成像：使用的实验步骤
8 用户工作表
9 附录
- 9.1 SignalStar 检验组合设计示例
- 9.2 故障排除和常见问题

1 介绍：SignalStar™ 染色方法

SignalStar™ 多重免疫组织化学 (mIHC) 是一种采用抗体、寡核苷酸（oligos）和荧光团探究细胞存在情况、位置、功能和生物标记物共表达模式的技术。SignalStar 技术使得在维持空间背景和组织结构的同时检测多个表型靶标与功能靶标成为可能。洞悉这些对了解细胞如何组织并相互作用以影响组织微环境及推动疾病进展和对治疗作出反应至关重要。

SignalStar 系统的力量存在于 SignalStar 抗体设计中。这些抗体已就用于福尔马林固定、石蜡包埋 (FFPE) 的组织中经过严格验证，并且随后使用位点特异性偶联和彻底纯化方法偶联至唯一寡核苷酸标签。使用高度特异的互补性寡核苷酸和荧光团网络，科学家可以放大 3-8 种靶标的信号，即使这些靶标处于低丰度亦如此。

图 1. 将您所选像素尺寸（最多 3-8 种唯一寡核苷酸偶联抗体）下的所有抗体按混合物添加于一个初级孵育步骤中。带荧光染料（信道：488、594、647 和 750）的互补性寡核苷酸通过构造与抗体接合的寡核苷酸-荧光团结构体，在第一轮成像中放大多达 4 种寡核苷酸偶联抗体的信号。如果像素尺寸大于 4，则柔和移除第一轮的寡核苷酸和荧光团，并且进行第二轮放大以可视化多达 4 种额外的寡核苷酸偶联抗体；互补性寡核苷酸系统和使用荧光团移除过程使得从同一底物放大第二轮抗体成为可能，同时无交叉反应性。然后将 2 幅图像用专有或开源软件以计算方式对齐并融合，以生成由多达 8 种靶标组成的图像。

2 溶液和试剂

2.1 包含的试剂盒组分

试剂盒中包含的材料

多达 8 种 SignalStar 寡核苷酸偶联抗体（见下文）

多达 8 种 SignalStar 互补性寡核苷酸（见下文）

SignalStar™ Antibody Diluent A

SignalStar™ Antibody Diluent B

SignalStar™ Amplification Buffer A

SignalStar™ Amplification Buffer B

SignalStar™ Amplification Oligo Set A:

488

594

647

750

SignalStar™ Amplification Oligo Set B:

488

594

647

750

SignalStar™ Ligation Buffer

T4 DNA 连接酶 (5 U/µL)

ATP (100 mM)

10X dsDNase Buffer

dsDNase

包括多达 8 种 SignalStar 寡核苷酸偶联抗体 (A) 和多达 8 种 SignalStar 互补性寡核苷酸 (B)，它们在订购时选定并随各自寡核苷酸-抗体对 (C) 成套提供。请参见以下示例。

SignalStar 寡核苷酸抗体

2.2 不包括所要求的试剂

SignalStain^® EDTA Unmasking Solution (10X) #14747
二甲苯（用于脱蜡）
乙醇，无水变性，组织学分级（100% 和 95%）
Decloaking Chamber (Biocare Medical, #DC2012)
Tris Buffered Saline with Tween 20 (TBST-10X) #9997
DAPI #4083
ProLong Gold Antifade Reagent #9071
Nuclease-free Water #12931
10% 中性缓冲福尔马林
低留置移液器吸头
载玻片处理容器
疏水屏障笔
玻璃盖片
带电荷载玻片
对照组织

3 开始之前的重要考虑事项

请勿合并相同荧光信道的互补性寡核苷酸。对于每个荧光信道，成像轮次可以含有仅 1 种互补性性寡核苷酸。切勿在相同成像轮次合并专属于相同荧光信道的互补性寡核苷酸，因为这会使分析结果不可解读。

切勿合并来自不同检验组合的抗体。 如果您同时运行多个检验组合，则必须为每个检验组合生成单独的抗体/互补性寡核苷酸混合物。

请确认您的 SignalStar 检验组合设计是否要求 2 轮成像。利用本文档第 9.1 节和第 8.1 节中的 SignalStar 检验组合设计和 SignalStar 检验组合设计工作表，获取指导和帮助。

确认您的显微镜可以检测此试剂盒中提供的荧光团。 成像时，除 DAPI 外，还存在 4 个需要采集的荧光信道。

荧光通道	激发光波长 (nm)	发射光波长 (nm)	激光线	通用滤光器
488	488	520	488	FITC
594	590	618	561/594	Texas Red
647	650	668	594/633	Cy^®5
750	752	776	633	Cy^®7

建议应通过将单张染色的载玻片对上述光谱成像，创建光谱库。 这将使得更好解混成为可能，以帮助最大限度降低光谱交叉干扰的可能性。

建议使用 DAPI 浓缩物，而不是含 DAPI 的封固剂。 DAPI 亮染便利更好地对齐图像。

如果溶液未充分混合，荧光信号可能变动不定或减弱。 使用低留置移液器吸头合并 SignalStar 试剂盒所有组分，并在室温颠倒转动 20 分钟。缓慢移液以确保准确度。 不使用时，所有 SignalStar 试剂盒组分均储存于冰上。一旦合并，SignalStar 溶液应保存在室温并迅速使用。

最佳地，载玻片应在完成染色的 8 小时以内成像。 如果载玻片未在这个时间段以内成像，则荧光信号可能减弱。

如果对本实验步骤有任何偏离，则不保证结果。 SignalStar 实验步骤用指定的抗原修复步骤和染色步骤开发并优化。

建议使用阳性对照载玻片。 每次运行中应纳入一种组织，其中生色性染色已经对该组织确认多重检验组合中存在所有靶标。

建议应按 1:100 使用每种抗体。 但是，供应了足以按 1:50 或 1:200 稀释度使用的抗体试剂。

在整个染色过程中，尽可能沥干孵育液和 dH₂O，同时不允许载玻片干透。 在每个步骤之后，从每张载玻片彻底拂去液体，然后继续下一个步骤。

4 SignalStar 第 1 轮成像：溶液配制

4.1 第 1 轮成像：SignalStar 溶液

一旦配制，SignalStar Imaging Round 1 Solution 应含有（随试剂盒订购的多达 8 种）所有抗体（包括用于第 1 轮成像和第 2 轮成像的那些抗体）和用于第 1 轮成像的互补性寡核苷酸。利用本文档第 9.1 节和第 8.1 节中的 SignalStar 检验组合设计示例和 SignalStar 检验组合设计工作表，获取指导和帮助。

请勿合并相同荧光信道的互补性寡核苷酸。

使用低留置移液器吸头配制溶液并在室温颠倒转动 20 分钟。缓慢移液以确保准确度。配制溶液时，所有 SignalStar 试剂盒组分均储存于冰上。一旦合并，SignalStar 溶液应保存在室温并迅速使用。

试剂盒组分	所需体积
试剂盒组分	5 张载玻片 (µL)	10 张载玻片 (µL)
SignalStar Antibody Diluent A	525	1,050
SignalStar Antibody Diluent B	225	450
SignalStar 寡核苷酸偶联抗体 1	7.5	15
SignalStar 寡核苷酸偶联抗体 2	7.5	15
SignalStar 寡核苷酸偶联抗体 3	7.5	15
SignalStar 寡核苷酸偶联抗体 4（如需要）	7.5	15
SignalStar 寡核苷酸偶联抗体 5（如需要）	7.5	15
SignalStar 寡核苷酸偶联抗体 6（如需要）	7.5	15
SignalStar 寡核苷酸偶联抗体 7（如需要）	7.5	15
SignalStar 寡核苷酸偶联抗体 8（如需要）	7.5	15
第 1 轮成像：SignalStar 互补性寡核苷酸 1	7.5	15
第 1 轮成像：SignalStar 互补性寡核苷酸 2	7.5	15
第 1 轮成像：SignalStar 互补性寡核苷酸 3	7.5	15
第 1 轮成像：SignalStar 互补性寡核苷酸 4（如需要）	7.5	15
总体积	840	1,680

4.2 第 1 轮成像：SignalStar Amplification Solution 1

试剂盒组分	所需体积
试剂盒组分	5 张载玻片 (µL)	10 张载玻片 (µL)
SignalStar Amplification Buffer A	3,000	6,000
SignalStar Amplification Buffer B	3,000	6,000
SignalStar Amplification Oligo A-488	60	120
SignalStar Amplification Oligo A-594	60	120
SignalStar Amplification Oligo A-647	60	120
SignalStar Amplification Oligo A-750	60	120
总体积	6,240	12,480

4.3 第 1 轮成像：SignalStar Amplification Solution 2

试剂盒组分	所需体积
试剂盒组分	5 张载玻片 (µL)	10 张载玻片 (µL)
SignalStar Amplification Buffer A	3,000	6,000
SignalStar Amplification Buffer B	3,000	6,000
SignalStar Amplification Oligo B-488	60	120
SignalStar Amplification Oligo B-594	60	120
SignalStar Amplification Oligo B-647	60	120
SignalStar Amplification Oligo B-750	60	120
总体积	6,240	12,480

4.4 第 1 轮成像：SignalStar Ligation Solution

试剂盒组分/试剂	所需体积
试剂盒组分/试剂	5 张载玻片 (µL)	10 张载玻片 (µL)
SignalStar 连接缓冲液	375	750
Nuclease-free Water #12931	352.5	705
T4 DNA 连接酶 (5 U/µL)	15	30
ATP (100 mM)	7.5	15
总体积	750	1,500

4.5 不包括额外的所需溶液

1X EDTA 修复液：要配制 250 ml 1X EDTA Unmasking Solution，将 25 ml SignalStain^® EDTA Unmasking Solution (10X) #14747 用 225 ml dH₂O 稀释。
10% 中性缓冲福尔马林
1X Tris Buffered Saline with Tween 20 (TBST)：要配制 1 L 1X TBST，将 10 ml Tris Buffered Saline with Tween 20 (TBST-10X) #9997 加入 900 ml dH₂O ，混合。

5 SignalStar 第 1 轮成像：使用的实验步骤

5.1 载玻片焙烘

	可以在您开始实验前当天焙烘载玻片。这个步骤允许固体石腊熔化。
	1. 将载玻片在 60°C 孵育 30 分钟。

5.2 脱蜡/水化

	一旦载玻片脱蜡，任何时候切勿让它们干透。加湿箱用于所有孵育步骤。确保每种溶液覆盖整个组织。
	2. 在二甲苯洗液中孵育切片 3 次，每次 5 分钟。
	3. 在 100% 乙醇洗液中孵育切片 2 次，每次 10 分钟。
	4. 在 95% 乙醇洗液中孵育切片 2 次，每次 10 分钟。
	5. 用 dH₂O 中洗涤切片 2 次，每次 5 分钟。

5.3 抗原修复

建议在加压蒸煮器中进行 EDTA 抗原修复，以最大限度修复表位。本实验步骤描述了对 Biocare Medical Decloaking Chamber #DC2012 建议的条件。设备专用设置和操作说明应用于其它加压蒸煮器。

6.	将载玻片放入 250 ml 室温 1X EDTA Unmasking Solution 中的 24 位载玻片架上。添加空白载玻片以彻底填充载玻片架。

7. 将 500 ml dH₂O 置入加压蒸煮器中。

8. 将切片夹放入加压蒸煮器，直至接触到隔热板。用载玻片容器盖子盖住一部分。

可能有利的是，将第二个以 250 mL 水和空白载玻片填充的 24 位载玻片架置入加压蒸煮器并用盖子盖住一部分。

9. 密封蒸煮器室，并继续进行修复。如下为 Biocare Medical Decloaking Chamber #DC2012 的设置：

SP1 125°C 持续 30 秒
SP2 90°C 持续 10 秒

10. 小心使设备通气，随后取下盖子。

11. 从去掩蔽室取出载玻片，允许在实验台上冷却 10 分钟。

12.	将载玻片容器置于 dH₂O 水龙头下，并向载玻片容器直接添加水直至所有 EDTA 均由 dH₂O 替换为止。

5.4 第 1 轮成像：染色

	13. 将载玻片在 150 μL SignalStar Imaging Round 1 Solution 中室温孵育 40 分钟。
	或者，可以将载玻片在 SignalStar Imaging Round 1 Solution 中 4°C 孵育过夜，以便将实验步骤拆分成多天。
	14. 从载玻片彻底拂去液体，然后浸没于 1X TBST 中 30 秒。
	15. 将载玻片在 10% 中性缓冲福尔马林中室温孵育 5 分钟。
	16. 从载玻片彻底拂去液体，然后浸没于 dH₂O 中 30 秒。

5.5 第 1 轮成像：扩增

17.	用 Amplification Solution 1 和 2 进行 8 轮放大。使用第 8.2 节中的 SignalStar 第 1 轮成像清单跟踪进度。每个放大轮次由以下步骤组成：

将载玻片在 150 μL Amplification Solution 1 中孵育 8 分钟。
从载玻片彻底拂去液体，然后浸没于 dH₂O 中 30 秒。
将载玻片在 150 μL Amplification Solution 2 中孵育 8 分钟。
从载玻片彻底拂去液体，然后浸没于 dH₂O 中 30 秒。

5.6 第 1 轮成像：连接

	18. 将载玻片在 150 μL SignalStar Ligation Buffer 中室温孵育 20 分钟。
	19. 从载玻片彻底拂去液体，然后浸没于 dH₂O 中 30 秒。

5.7 第 1 轮成像：图像

	20. 根据数据表说明，配制 DAPI #4083 溶液。
	21. 将载玻片浸没于 1X TBST 中 30 秒。
	22. 用 DAPI 溶液复染。
	23. 将载玻片浸没于 1X TBST 中 30 秒。
	24. 将载玻片用 ProLong Gold Antifade Reagent #9071 封装。
	25. 尽快对载玻片成像。信号应保持稳健长达 8 小时。

6 SignalStar 第 2 轮成像：溶液配制

SIGNALSTAR 第 2 轮成像仅为要求两个成像轮次的抗体检验组合所需。利用本文档第 9.1 节和第 8.1 节中的 SignalStar 检验组合设计示例和 SignalStar 检验组合设计工作表，获取指导和帮助。

6.1 第 2 轮成像：SignalStar Fluorescent Removal Solution

试剂盒组分/试剂	所需体积
试剂盒组分/试剂	5 张载玻片 (µL)	10 张载玻片 (µL)
10X dsDNase Buffer	75	150
dsDNase	7.5	15
Nuclease-free Water #12931	667.5	1,335
总体积	750	1,500

6.2 第 2 轮成像：SignalStar 溶液

一旦配制，SignalStar SignalStar Imaging Round 2 Solution 应仅含有用于第 2{2} 轮成像的互补性寡核苷酸。利用本文档第 9.1 节和第 8.1 节中的 SignalStar 检验组合设计示例和 SignalStar 检验组合设计工作表，获取指导和帮助。

不向 SIGNALSTAR IMAGING ROUND 2 SOLUTION 添加抗体-寡核苷酸偶联物。

请勿合并相同荧光信道的互补性寡核苷酸。

试剂盒组分	所需体积
试剂盒组分	5 张载玻片 (µL)	10 张载玻片 (µL)
SignalStar Antibody Diluent A	525	1,050
SignalStar Antibody Diluent B	225	450
第 2 轮成像：SignalStar 互补性寡核苷酸 5	7.5	15
第 2 轮成像：SignalStar 互补性寡核苷酸 6（如需要）	7.5	15
第 2 轮成像：SignalStar 互补性寡核苷酸 7（如需要）	7.5	15
第 2 轮成像：SignalStar 互补性寡核苷酸 8（如需要）	7.5	15
总体积	780	1,560

6.3 第 2 轮成像：SignalStar Amplification Solution 1

试剂盒组分	所需体积
试剂盒组分	5 张载玻片 (µL)	10 张载玻片 (µL)
SignalStar Amplification Buffer A	3,000	6,000
SignalStar Amplification Buffer B	3,000	6,000
SignalStar Amplification Oligo A-488	60	120
SignalStar Amplification Oligo A-594	60	120
SignalStar Amplification Oligo A-647	60	120
SignalStar Amplification Oligo A-750	60	120
总体积	6,240	12,480

6.4 第 2 轮成像：SignalStar Amplification Solution 2

试剂盒组分	所需体积
试剂盒组分	5 张载玻片 (µL)	10 张载玻片 (µL)
SignalStar Amplification Buffer A	3,000	6,000
SignalStar Amplification Buffer B	3,000	6,000
SignalStar Amplification Oligo B-488	60	120
SignalStar Amplification Oligo B-594	60	120
SignalStar Amplification Oligo B-647	60	120
SignalStar Amplification Oligo B-750	60	120
总体积	6,240	12,480

6.5 第 2 轮成像：SignalStar Ligation Solution

试剂盒组分/试剂	所需体积
试剂盒组分/试剂	5 张载玻片 (µL)	10 张载玻片 (µL)
SignalStar 连接缓冲液	375	750
Nuclease-free Water #12931	352.5	705
T4 DNA 连接酶 (5 U/µL)	15	30
ATP (100 mM)	7.5	15
总体积	750	1,500

7 SignalStar 第 2 轮成像：使用的实验步骤

	SIGNALSTAR 第 2 轮成像仅为要求两个成像轮次的抗体检验组合所需。利用本文档第 9.1 节和第 8.1 节中的 SignalStar 检验组合设计示例和 SignalStar 检验组合设计工作表，获取指导和帮助。
	一旦成像完成，就可以从载玻片移除荧光信号，从而可以进行另一轮成像。在第一轮成像后尽快执行下一组步骤。

7.1 移除荧光信号

	1. 采集图像后，将载玻片浸泡于 dH₂O 中 ≥30 分钟，以轻柔取下盖玻片而不损坏组织。
	2. 将载玻片在 37°C 于 150 μL SignalStar Fluorescent Removal Solution 中孵育 2 小时。
	3. 将载玻片浸没于 dH₂O 中 30 秒。
	4. 可选：用 ProLong Gold Antifade Reagent #9071 with DAPI #4083 封装载玻片，并对载玻片成像以确认无荧光信号余留。将载玻片浸泡于 dH₂O 中 ≥30 分钟，以轻柔取下盖玻片而不损坏组织。将载玻片浸没于 dH₂O 中 30 秒。

7.2 第 2 轮成像：染色

	5. 将载玻片在室温于 150 μL SignalStar 第 2 轮成像液中孵育 40 分钟。
	6. 从载玻片彻底拂去液体，然后浸没于 dH₂O 中 30 秒。

7.3 第 2 轮成像：扩增

7.	用 Amplification Solution 1 和 2 进行 8 轮放大。使用第 8.3 节中的 SignalStar 第 2 轮成像清单跟踪进度。每个放大轮次由以下步骤组成：

将载玻片在 150 μL Amplification Solution 1 中孵育 8 分钟。
从载玻片彻底拂去液体，然后浸没于 dH₂O 中 30 秒。
将载玻片在 150 μL Amplification Solution 2 中孵育 8 分钟。
从载玻片彻底拂去液体，然后浸没于 dH₂O 中 30 秒。

7.4 第 2 轮成像：连接

	8. 将载玻片在 150 μL SignalStar Ligation Buffer 中室温孵育 20 分钟。
	9. 从载玻片彻底拂去液体，然后浸没于 dH₂O 中 30 秒。

7.5 第 2 轮成像：图像

	10. 根据数据表说明，配制 DAPI #4083 溶液。
	11. 将载玻片浸没于 1X TBST 中 30 秒。
	12. 用 DAPI 溶液复染。
	13. 将载玻片浸没于 1X TBST 中 30 秒。
	14. 从载玻片彻底拂去液体，然后浸没于 dH₂O 中 30 秒。
	15. 将载玻片用 ProLong Gold Antifade Reagent #9071 封装。
	16. 尽快对载玻片成像。信号应保持稳健长达 8 小时。

8 用户工作表

8.1 SignalStar 检验组合设计工作表

寡核苷酸偶联抗体	互补性寡核苷酸	。	488	594	647	750

（参见附录 9.1，了解检验组合设计示例）

8.2 SignalStar 第 1 轮成像清单

放大轮次	步骤编号	✓	步骤
第 1 轮放大	1	☐	在 SignalStar™ Amplification Solution 1 中孵育 8 分钟。
	2	☐	将载玻片浸没于 dH₂O 中 30 秒。
	3	☐	在 SignalStar™ Amplification Solution 2 中孵育 8 分钟。
	4	☐	将载玻片浸没于 dH₂O 中 30 秒。
第 2 轮放大	5	☐	在 SignalStar™ Amplification Solution 1 中孵育 8 分钟。
	6	☐	将载玻片浸没于 dH₂O 中 30 秒。
	7	☐	在 SignalStar™ Amplification Solution 2 中孵育 8 分钟。
	8	☐	将载玻片浸没于 dH₂O 中 30 秒。
第 3 轮放大	9	☐	在 SignalStar™ Amplification Solution 1 中孵育 8 分钟。
	10	☐	将载玻片浸没于 dH₂O 中 30 秒。
	11	☐	在 SignalStar™ Amplification Solution 2 中孵育 8 分钟。
	12	☐	将载玻片浸没于 dH₂O 中 30 秒。
第 4 轮放大	13	☐	在 SignalStar™ Amplification Solution 1 中孵育 8 分钟。
	14	☐	将载玻片浸没于 dH₂O 中 30 秒。
	15	☐	在 SignalStar™ Amplification Solution 2 中孵育 8 分钟。
	16	☐	将载玻片浸没于 dH₂O 中 30 秒。
第 5 轮放大	17	☐	在 SignalStar™ Amplification Solution 1 中孵育 8 分钟。
	18	☐	将载玻片浸没于 dH₂O 中 30 秒。
	19	☐	在 SignalStar™ Amplification Solution 2 中孵育 8 分钟。
	20	☐	将载玻片浸没于 dH₂O 中 30 秒。
第 6 轮放大	21	☐	在 SignalStar™ Amplification Solution 1 中孵育 8 分钟。
	22	☐	将载玻片浸没于 dH₂O 中 30 秒。
	23	☐	在 SignalStar™ Amplification Solution 2 中孵育 8 分钟。
	24	☐	将载玻片浸没于 dH₂O 中 30 秒。
第 7 轮放大	25	☐	在 SignalStar™ Amplification Solution 1 中孵育 8 分钟。
	26	☐	将载玻片浸没于 dH₂O 中 30 秒。
	27	☐	在 SignalStar™ Amplification Solution 2 中孵育 8 分钟。
	28	☐	将载玻片浸没于 dH₂O 中 30 秒。
第 8 轮放大	29	☐	在 SignalStar™ Amplification Solution 1 中孵育 8 分钟。
	30	☐	将载玻片浸没于 dH₂O 中 30 秒。
	31	☐	在 SignalStar™ Amplification Solution 2 中孵育 8 分钟。
	32	☐	将载玻片浸没于 dH₂O 中 30 秒。

8.3 SignalStar 第 2 轮成像清单

放大轮次	步骤编号	✓	步骤
第 1 轮放大	1	☐	在 SignalStar™ Amplification Solution 1 中孵育 8 分钟。
	2	☐	将载玻片浸没于 dH₂O 中 30 秒。
	3	☐	在 SignalStar™ Amplification Solution 2 中孵育 8 分钟。
	4	☐	将载玻片浸没于 dH₂O 中 30 秒。
第 2 轮放大	5	☐	在 SignalStar™ Amplification Solution 1 中孵育 8 分钟。
	6	☐	将载玻片浸没于 dH₂O 中 30 秒。
	7	☐	在 SignalStar™ Amplification Solution 2 中孵育 8 分钟。
	8	☐	将载玻片浸没于 dH₂O 中 30 秒。
第 3 轮放大	9	☐	在 SignalStar™ Amplification Solution 1 中孵育 8 分钟。
	10	☐	将载玻片浸没于 dH₂O 中 30 秒。
	11	☐	在 SignalStar™ Amplification Solution 2 中孵育 8 分钟。
	12	☐	将载玻片浸没于 dH₂O 中 30 秒。
第 4 轮放大	13	☐	在 SignalStar™ Amplification Solution 1 中孵育 8 分钟。
	14	☐	将载玻片浸没于 dH₂O 中 30 秒。
	15	☐	在 SignalStar™ Amplification Solution 2 中孵育 8 分钟。
	16	☐	将载玻片浸没于 dH₂O 中 30 秒。
第 5 轮放大	17	☐	在 SignalStar™ Amplification Solution 1 中孵育 8 分钟。
	18	☐	将载玻片浸没于 dH₂O 中 30 秒。
	19	☐	在 SignalStar™ Amplification Solution 2 中孵育 8 分钟。
	20	☐	将载玻片浸没于 dH₂O 中 30 秒。
第 6 轮放大	21	☐	在 SignalStar™ Amplification Solution 1 中孵育 8 分钟。
	22	☐	将载玻片浸没于 dH₂O 中 30 秒。
	23	☐	在 SignalStar™ Amplification Solution 2 中孵育 8 分钟。
	24	☐	将载玻片浸没于 dH₂O 中 30 秒。
第 7 轮放大	25	☐	在 SignalStar™ Amplification Solution 1 中孵育 8 分钟。
	26	☐	将载玻片浸没于 dH₂O 中 30 秒。
	27	☐	在 SignalStar™ Amplification Solution 2 中孵育 8 分钟。
	28	☐	将载玻片浸没于 dH₂O 中 30 秒。
第 8 轮放大	29	☐	在 SignalStar™ Amplification Solution 1 中孵育 8 分钟。
	30	☐	将载玻片浸没于 dH₂O 中 30 秒。
	31	☐	在 SignalStar™ Amplification Solution 2 中孵育 8 分钟。
	32	☐	将载玻片浸没于 dH₂O 中 30 秒。

9 附录

9.1 SignalStar 检验组合设计示例

寡核苷酸偶联抗体	互补性寡核苷酸	产品对编号	。	488	594	647	750
PD-1 (Intracellular Domain) (D4W2J) XP^® Rabbit mAb (SignalStar™ Conjugate 0008)	互补性寡核苷酸 (CO-0008-488)	17942	1	●
PD-L1 (E1L3N^®) XP^® Rabbit mAb (SignalStar™ Conjugate 0005)	互补性寡核苷酸 (CO-0005-594)	28249	1		●
TIM-3 (D5D5R™) XP^® Rabbit mAb (SignalStar™ Conjugate 0010)	互补性寡核苷酸 (CO-0010-647)	15231	1			●
Ki-67 (8D5) Mouse mAb (SignalStar™ Conjugate 0014)	互补性寡核苷酸 (CO-0014-750)	56398	1				●
CD8ɑ (D8A8Y) Rabbit mAb (SignalStar™ Conjugate 0004)	互补性寡核苷酸 (CO-0004-488)	45747	2	●
CD68 (D4B9C) XP^® Rabbit mAb (SignalStar™ Conjugate 0007)	互补性寡核苷酸 (CO-0007-594)	77318	2		●
CD20 (E7B7T) XP^® Rabbit mAb (SignalStar™ Conjugate 0011)	互补性寡核苷酸 (CO-0011-647)	36775	2			●
Pan-Keratin (C11) Mouse mAb (SignalStar™ Conjugate 0003)	互补性寡核苷酸 (CO-0003-750)	97227	2				●

9.2 故障排除和常见问题

如何验证 SignalStar Multiplex IHC 试剂盒和试剂？

CST 彻底验证了 SignalStar Multiplex IHC Panel Builder 菜单中可提供的每种抗体。通过滴定和荧光团配对以及在两轮成像中测试抗体的各种组合。对各种肿瘤和组织类型进行测试。我们还严格测试了传统显色测定法中使用的亲本抗体，因这些抗体充当这种荧光测定法的基础。

该测定法是否对冷冻组织有效？

尚未验证 SignalStar Multiplex IHC 试剂盒与试剂用于冷冻组织。我们正处于验证我公司抗体和实验步骤用于新鲜组织或冷冻组织的流程中。

你们是否有抗小鼠抗体可提供？

尚未验证 SignalStar Multiplex IHC 试剂盒和试剂用于小鼠组织。我们正处于验证小鼠反应性抗体的流程中。

我没在你们的可提供抗体菜单中看到我感兴趣的目标。我还能以某种方式在我的检测板中使用它吗？

尚未验证 SignalStar Multiplex IHC 试剂盒和试剂配合我公司菜单以外的抗体使用。我们正在处于开发诸多定制解决方案以便在 SignalStar Multiplex IHC 测定法中使用您自有抗体的流程中。

我能否将此检测中使用的抗体与直接偶联物组合？

尚未验证 SignalStar Multiplex IHC 试剂盒和试剂与直接偶联物组合使用。有可能将直接偶联物并入您的实验步骤。然而，由于 SignalStar 试剂受益于荧光信号放大，因此可能存在光谱渗出，后者因使用偶联物未放大的测定法产生。

将我的 SignalStar 染色与系列切片上的生色性染色比较时，我看到更多阳性细胞。我如何知道这种过度染色是否正确？

在优化过程期间，我们已发现荧光染色可能比生色性染色显示更高的阳性%。为确保任何过度染色为特异性，请确认用其他染色剂证明亚细胞定位和共定位正确。例如，如果所有 CD8^＋细胞都为 CD3^＋，则任何与显色性染色相比的 CD8^＋过度染色很可能是正确的。

完成染色后我可能等多久才对切片成像？

对于第 1 轮成像，在完成染色后 8 小时内成像时，染色应显示稳定信号。对于第 2 轮成像，成像应尽可能接近于染色完成时进行，但是应当保持稳定长达 8 小时。

我是否需要针对自己正在使用的组织类型优化 SignalStar Multiplex IHC 试剂盒和试剂？

SignalStar Multiplex IHC 试剂盒和试剂已针对抗体的荧光团配对和顺序作了优化。由于组织在靶标的质量和表达水平方面不同，将您的检验组合中抗体的浓度升高 2 倍或降低 0.5 倍可能有助在您的实验中实现最佳信号。

该测定法中应包括哪种适当的阳性对照？是否需要多个对照？

通过显色性 IHC 证明每个靶标呈阳性的任何组织都可以充当阳性对照组织。因此，每个靶标都将要求阳性对照，这有时可能导致多个对照必不可少。为了最佳比较，各切片应尽可能连续。

仅供研究使用。不得用于诊断流程。

Cell Signaling Technology、XP 和 SignalStar 均是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。
E1L3N 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的注册商标。Cy 和 CyDye 是 GE Healthcare 的注册商标。所有其他商标均属各自所有者专有。访问我们的商标信息页面。
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发布时间 2023 年 7 月

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