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SignalStar™ Multiplex IHC 疑难排解指南

SignalStar Multiplex IHC 试剂盒和试剂针对手动实验步骤和 Leica Biosystems 的 BOND RX 全自动研究染色机实验步骤进行了优化和验证。但如果您需要解答在检测中遇到的问题，请参阅下面的列表以了解以下潜在的问题、可能的原因和建议。

潜在的问题

无荧光信号

描述 可能的原因 建议
所有通道都看不到荧光信号，我的切片是空白的。 有可能在染色过程中遗漏了试剂盒的关键成分。 在进行检测之前，确认添加了所有试剂。
该组织可能不表达目的生物标记物。

有必要使用对照切片以排除任何潜在的试剂问题。

进行显色性染色以确认组织中生物标记物的表达。

弱荧光信号

描述 可能的原因 建议
所有通道都能看到信号，但信号比预期弱得多。 SignalStar 试剂和溶液粘稠。SignalStar 溶液（尤其是放大液 1 和 放大液 2）的混合可能不充分。 使用低吸附移液器吸头合并 SignalStar 试剂盒所有组分，并在室温上下颠倒转动 20 分钟。
在应用放大液 2 之前的洗涤步骤后，可能残留有残余的放大液 1。 确保每个切片完全浸入 dH2O 中，并在应用放大液之前通过轻弹载玻片从组织表面去除多余的液体。
BOND RX 自动染色机上的溶液清洗不充分。 如 BOND RX 实验步骤中所述，确保在 BOND RX 软件中将所有洗涤步骤选择为“打开”。
如果切片未在染色后 8 小时内成像，则荧光信号可能减弱。 确保染色后尽快在最长 8 小时内对切片进行成像。
在手动实验步骤期间执行的扩增可能少于 8 个完整轮次。 在这些步骤期间，使用手动实验步骤中提供的清单。
在 BOND RX 实验步骤期间执行的扩增可能少于 6 个完整轮次。 在这些步骤期间，使用手动实验步骤中提供的清单。
虽然所有抗体都经过彻底验证可用于许多组织，但组织质量和表达水平各不相同。 增加抗体量（2 倍）将增加信号强度。
扫描时使用了错误的荧光成像仪设置或滤光片组。

确认使用了正确的滤光片组来可视化 488、594、647 和 750 nm 通道。

请参阅实验步骤中提供的荧光通道详细信息。

确保使用 Texas Red 滤光片组来可视化 594 nm 通道。不兼容 TRITC 滤光片。

缺少一个荧光信号

描述 可能的原因 建议
我在其中一个荧光通道中没有看到任何信号，但序列切片上的显色染色表明该标记物有很强的信号。 没有为该荧光通道添加互补性寡核苷酸。 在进行检测之前，确认添加了所有试剂。
没有为该荧光通道添加扩增寡核苷酸 A 或 B。 在进行检测之前，确认添加了所有试剂。
可能是使用了不正确的激光和滤光片组对切片进行成像。 该实验步骤包含有关此检测中使用的所有荧光团的激光、滤光片套装、激发和发射的信息。确认您的仪器设置相符。
扫描时使用了错误的荧光成像设置或滤光片组。 确认使用了正确的滤光片组来可视化 488、594、647 和 750 nm 通道。请参阅实验步骤中提供的荧光通道详细信息。确保使用 Texas Red 滤光片组来可视化 594 nm 通道。不兼容 TRITC 滤光片。

背景和自发荧光

描述 可能的原因 建议
我的Panel的某些通道中存在背景荧光。 虽然所有抗体都经过彻底验证可用于许多组织，但组织质量和表达水平各不相同。 减少抗体量（0.5 倍）可能有助于降低背景水平，同时保持信号强度。
所有抗体均已在实验步骤中描述的抗原修复方法的背景下进行了验证。如果使用替代方法，可能会导致更高的背景水平。 确保您使用实验步骤中所述的抗原修复方法。
使用手动实验步骤，可以在通道中执行更少的扩增循环以减少噪音。 例如，要在 488、594 和 750 nm 通道中执行 8 次扩增循环，但仅在 647 nm 通道中执行 6 次：为所有通道的 6 轮扩增制作放大液。然后，制备由 488、594 和 750 的扩增寡核苷酸组成的单独放大液，用于最后的 2 轮扩增。
我在组织切片的坏死区域中看到相当多的背景（与显色不符）。有什么方法可以减少这种情况吗？ 用任何检测方法可能都难以对坏死组织进行染色。当涉及到染料、寡核苷酸和抗体本身的非特异性结合时，它通常比组织的其他部分“更粘”。 您可以尝试降低抗体浓度，以便保留特异性信号，但坏死区域中的非特异性信号不保留。或者，如果坏死区域的染色与其他地方的特异性信号一样亮，那么您可以只专注于对非坏死区域进行成像（如果可能）。
我正在处理高自发荧光脑组织切片，并在 488 nm 通道中看到大量背景。我该怎么做才能尽量减少这种情况？ 检测到的生物标记物的自发荧光水平可能很高，但信号强度却很弱。

虽然我们在优化过程中使用了多种肿瘤和组织类型，但我们并没有对每种类型进行验证。高度自发荧光、没有立即固定的组织等在任何检测中都很难染色。您可以尝试滴定寡核苷酸偶联抗体，以增加或减少您看到的信号。此外，还可以使用旨在降低自发荧光的试剂，例如 TrueBlack Liposfuscin。

在检测板设计期间可以考虑自发荧光，以便在 488 nm 通道中放置强表型标记物，而不是表达较弱的生物标记物。

重叠信号

描述 可能的原因 建议
我在单个通道中看到来自多个生物标记物的荧光信号。 第 1 轮成像和第 2 轮成像的互补性寡核苷酸可能被错误合并，从而扩增了同一通道内的 2 个生物标记物。 请确保您不会合并同一轮成像中相同荧光信道的互补性性寡核苷酸。对于每个荧光信道，成像轮次可以含有仅 1 种互补性性寡核苷酸。
扫描时使用了错误的荧光成像仪设置或滤光片设置。

确认使用了正确的滤光片组来可视化 488、594、647 和 750 nm 通道。请参阅实验步骤中提供的荧光信道详细信息。确保使用 Texas Red 滤光片组来可视化 594 nm 通道。不兼容 TRITC 滤光片。

如果您的成像仪器的特性不适合分离这些荧光信道，则可以使用光谱库通过计算分离荧光信号。
来自生物标记物的类似信号存在于多个荧光通道中。例如，647 nm 通道中的染色与 594 nm 通道中的生物标记物相似。

这可能是由于 594 nm 通道中缺乏生物标记物表达，使得该通道中几乎没有信号或根本没有信号。

同时，647 nm 通道中可能存在强表达，使得光谱渗漏导致了 594 nm 通道中的信号。

由于这种现象，594 nm 通道中的弱特异性信号可能会被淹没。

减少 647 nm 通道中的抗体量可能有助于解决此信号渗漏问题。

在检测板设计期间可以考虑光谱渗漏，从而将强表型标记物与弱表达标记物进行光谱分离。

BOND RX 软件错误

描述 可能的原因 建议
BOND 滴定插入物已脱离其载体，从而导致 BOND RX 自动染色机发生故障且无法完成染色运行。 在对第 1 轮成像和第 2 轮成像执行 SignalStar 检测后，未运行抽吸探针清洁循环。 每次运行 SignalStar 后，始终运行抽吸探针清洁循环。

如需其他信息和帮助，请联系您的仪器提供商。
我在 BOND RX 软件上收到一条“空”容器错误消息。 如果容器装得太满，BOND RX 自动染色机将认为容器是“空的”。

确保打开的容器没有过量填充 SignalStar 试剂。再次扫描容器。如果列为“空”，请点击“标记为非空”。请点击“再填充”。确保添加适量的试剂。

如 BOND RX 实验步骤中所示，某些试剂可能需要多个容器。

如需其他信息和帮助，请联系您的仪器提供商。
我在 BOND RX 软件中收到此错误消息：“试剂不足。” 尽管使用了 SignalStar Multiplex IHC 实验步骤中指示的正确量的溶液，但 BOND RX 自动染色机可能仍会认为试剂“不足”。 再次尝试装溶液，并扫描容器。您可能需要使用新的容器来消除此错误。

如需其他信息和帮助，请联系您的仪器提供商。

访问技术支持页面，搜索 SignalStar 相关的疑难问题解答信息和技术问题的答案。

Cell Signaling Technology、CST 和 SignalStar 均是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。Cy 是 GE Healthcare 的注册商标。所有其他商标均属各自所有者专有。访问 cellsignal.com/trademarks 以了解更多信息。

第 10,781,477 号美国专利，外国对应物，以及由此而来的儿童专利。

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