免疫沉淀法实验设计提示

什么是免疫沉淀 (IP)？IP 是如何工作的？

免疫沉淀法 (IP) 是指从不均一的细胞或组织提取物中使用靶标特异性抗体富集特定蛋白质的一项技术。免疫共沉淀 (co-IP) 是完整蛋白质复合体的沉淀过程。IP 和 co-IP 是广泛运用于鉴定蛋白质-蛋白质相互作用和蛋白质复合体中新成员的一项重要技术。虽然 IP 技术相对简单，但涉及众多变量，并且纳入恰当实验对照对优化和 IP 结果准确解读至关重要。

免疫沉淀提示

• 使用针对您的靶标蛋白质的特异性高质量抗体，并针对您将要进行的免疫沉淀类型进行验证。
• 根据您的细胞类型或组织使用适当的裂解缓冲液。
• 优化 IP 中使用的抗体和珠子的量。
• 彻底清洗珠子以去除非特异性结合的蛋白质。离心后，用移液器除去液体，不要用真空抽吸。
• 使用适当的洗脱缓冲液洗脱与珠子结合的蛋白质。
• 通过蛋白质印迹法或质谱法分析洗脱的蛋白质。

如何分析免疫沉淀实验？

通常，使用蛋白质印迹 (WB) 读数来分析 IP 和 co-IP 实验的结果。可以遵循 IP 的标准实验步骤，并结合蛋白免疫印迹实验步骤。或者，可以按照标准 IP 实验步骤，通过质谱法分析 IP 和 co-IP 实验，并进行如下所述的细微调整。尽管 WB 分析用于检测单个感兴趣的蛋白质或疑似结合伙伴，但质谱法却可以通过一次实验检测和鉴定多个肽和蛋白质。这使得它对于发现驱动的实验很有用，在这些实验中，通过免疫沉淀来富集肽和蛋白质群体，而不是单个蛋白质或蛋白质复合物。一种可用的基于质谱的方法是 PTMScan^® 方法，它可以富集、识别和量化所选细胞内激酶的多种蛋白质底物，从而更容易地表征响应实验刺激（如潜在的药物治疗）的细胞内信号转导状态。

免疫沉淀的类型以及如何选择用于 IP 和下游分析的抗体

单蛋白 IP

单蛋白免疫沉淀涉及对靶标蛋白的富集，随后对同一蛋白进行检测。

一种典型的免疫沉淀程序，其中靶标蛋白质（红色）被富集并从裂解物中的其他蛋白质（蓝色）中分离。最右边的方块代表蛋白质印迹分析。泳道标签：M，标记物；I，输入裂解物；B，结合分数（免疫沉淀）；U，未结合部分。

在天然蛋白质的免疫沉淀实验步骤中，裂解物中的蛋白质不会变性并保留其天然的折叠构象。或者，免疫沉淀可以在变性条件下进行，其中蛋白质部分解折叠或完全变性。

单蛋白 IP 的抗体选择

选择经过免疫沉淀验证的抗体。请注意，已验证适合天然免疫沉淀的抗体可能无法在变性条件下发挥作用。

最常见的是，未结合的抗体用于 IP 富集，但与链霉亲和素-珠子偶联物或直接与珠子偶联的抗体结合使用的生物素化抗体是替代策略，将在本节后面说明。

单蛋白免疫沉淀 (IP) 的蛋白质印迹分析抗体选择

单蛋白质 IP 实验最常规的分析方法是采用蛋白质印迹法。用于 IP 的抗体，只要在 WB 中得到验证，也可用作 WB 检测的一抗。如果没有经过验证，则应选择一个经过 WB 验证的针对靶标的不同抗体。

通过质谱/蛋白质组学进行单蛋白质 IP 分析

单蛋白质免疫沉淀后的目的蛋白，可以通过质谱方法直接分析。使用标准的自下而上蛋白质组学工作流程，通过液相色谱串联质谱 (LC-MS/MS) 分析所得的蛋白水解肽，以表征捕获的蛋白质，从而获得肽序列信息并识别现有的翻译后修饰。另一种方法是使用自上而下的 LC-MS 方法来分析捕获的蛋白质，以监测蛋白质的完整质量，并识别是否存在翻译后修饰（如磷酸化或其他侧链修饰），或者是否有截短的情况（例如通过内源性蛋白酶切割或剪切掉前导序列）。

免疫共沉淀

免疫共沉淀 (co-IP) 是一种通过富集天然蛋白质复合物来研究蛋白质-蛋白质相互作用的方法。一种蛋白质（称为“诱饵”）是免疫沉淀的靶标，而复合物中的另一种蛋白质（称为“猎物”）则作为读数进行分析。这种实验在非变性条件下进行，以保持蛋白质复合物的完整性。

这是一个典型的共免疫沉淀程序，其中含有诱饵蛋白（红色）和猎物蛋白（绿色）的免疫复合物被富集并从裂解物中的其他蛋白质（蓝色）中分离。最右边的方块代表蛋白质印迹分析。泳道标签：M，标记物；I，输入裂解物；B，结合分数（免疫沉淀）；U，未结合部分。

Co-IP 的抗体选择

为“诱饵”蛋白选择经过 IP 验证的抗体，同时牢记所需的目标和物种特异性。理想情况下，抗体识别的表位应该表达在蛋白质复合物的表面，而不是隐藏在结构内部。

表位或亲和标签（例如 GST 或 Myc-Tag）为 co-IP 实验的设计提供了额外的灵活性。简而言之，将编码目的蛋白或蛋白结构域的 DNA 与编码亲和标签的 DNA 拼接起来，然后所得的融合蛋白在细胞中表达。与标签特异性结合的抗体用于免疫沉淀融合蛋白及其结合伙伴。当无法获得针对“诱饵”蛋白（即目的蛋白）的经过 IP 验证的抗体时，这种方法特别有用。然而，融合蛋白的过表达可能会改变蛋白复合物的结构和/或组成。考虑设计后续实验，例如将猎物蛋白和诱饵蛋白进行转换的反向共免疫沉淀 (co-IP)，以支持对蛋白质-蛋白质相互作用的解释。

浏览表位标签抗体

另请参见：偶联抗体选择

用于 Co-IP 蛋白质印迹分析的抗体选择

当研究人员假设特定的猎物蛋白与诱饵蛋白相互作用时，通常采用蛋白质印迹读数。选择经过 WB 验证的针对“猎物”蛋白的抗体进行检测，同样要牢记物种和靶标特异性。

Co-IP 分析：质谱/蛋白质组学

或者，可以采用自下而上的蛋白质组学方法，通过液相色谱-质谱 (LC-MS/MS) 来识别蛋白质复合物的成分，这将提供有关富集蛋白质的蛋白水解肽的初级肽序列信息。由于富集水平高、非特异性结合低，因此可以通过 MALDI MS 检查组成蛋白质以监测其完整质量，或者可以通过电喷雾电离质谱 (ESI-MS) 分析其完整质量和序列确认¹。

肽段 IP 的抗体选择

肽段 IP 涉及蛋白质片段或大肽的富集。这可能是在体内由内源性降解产生的，或者是在体外由传统的自下而上的蛋白质组学样品处理产生的，然后读取相同的靶标。与单蛋白 IP 一样，肽 IP 中最常用的是未结合抗体，但也可以使用生物素化抗体或直接与珠子结合的抗体。

肽段 IP 分析：质谱/蛋白质组学

通过选择广泛针对蛋白质区域或多种蛋白质中表达的翻译后修饰的抗体，还可以从蛋白质组中富集更多的靶标肽。富集的靶标肽可通过液相色谱和串联质谱 (LC-MS/MS) 或基质辅助激光解吸电离质谱 (MALDI MS) 进行鉴定，并使用蛋白质组学软件进行分析。

使用偶联抗体 进行IP 的抗体选择

偶联抗体 IP 是指使用已直接与抗体偶联的珠子进行免疫沉淀。当抗体的存在可能会干扰检测方法（例如 MALDI-MS）时，可以考虑使用固定抗体 IP。

选择已通过 IP 验证的抗体-珠子偶联物。珠子底物可以是琼脂糖或磁性的。CST 提供用于免疫共沉淀的固定表位标签抗体：

浏览 IP 固定抗体

免疫沉淀的微珠选择

微珠介质：琼脂糖和磁珠

IP 通常使用琼脂糖或磁珠进行。琼脂糖珠用于通过离心将蛋白质从大量样品中分离出来，而磁珠则在专门的磁力架上分离。两种分离方法对 IP 都表现出相似的性能。

CST 为 IP 实验提供以下珠类型：

	琼脂糖珠	磁珠
蛋白 A 表面	Protein A Agarose Beads #9863	Protein A Magnetic Beads #73778
蛋白 G 表面	Protein G Agarose Beads #37478	Protein G Magnetic Beads #70024

为了最大限度地减少洗涤步骤中珠子和免疫沉淀物质的损失，用移液器去除沉淀珠子的上清液。不要用真空吸出上清液。

固定抗体 IP 的珠子选择在抗体选择部分中有所涵盖。

珠子表面：蛋白 A、蛋白 G 和链霉亲和素

当使用未偶联抗体进行免疫沉淀时，通常选择与蛋白 A 或蛋白 G 连接的珠子进行天然 IP 或 co-IP。蛋白 A 和蛋白 G 在 IP 反应过程中直接结合抗体的 Fc 结构域，并促进后续的分离。一般建议，对于未偶联的兔 IgG 抗体选择蛋白 A 偶联的珠子，或对于未偶联的小鼠 IgG 抗体选择蛋白 G 偶联的珠子。有关蛋白 A 和蛋白 G 对各种抗体宿主物种和免疫球蛋白亚类的相对结合亲和力的更多详细信息，请参考下表。

抗体对蛋白 A 和蛋白 G 的结合亲和力

物种	IgG 类	蛋白 A	G 蛋白
鸡蛋	IgY	—	—
奶牛	IgG	—	+
犬	IgG	+	+
	IgM	+	—
山羊	IgG	+	+++
	IgM	—	—
马	IgG	+++	+++
兔	IgG	+++	+++
	IgM	—	—
大鼠	IgG	+	++
	IgM	—	—
绵羊	IgG	+++	+++
	IgM	—	—
小鼠	IgG1	+	++
	IgG2a	++	++
	IgG2b	++	++
	IgG3	+	++
	IgM	++	+
	IgA	++	++
人	lgG1	+++	+++
	IgG2	+++	+++
	IgG3	—	+++
	IgG4	+++	+++
	IgA	+	—
	IgM	+	—
	IgE	+	—

—，无结合；＋，弱结合；++，中度结合；+++，强结合。

改编自 David S. Hage 所著的《亲和色谱手册》(ISBN 0824740572)。Terry M. Phillips 撰写的章节14“抗体和抗原纯化中的亲和层析技术”。

链霉亲和素珠结合物

对于使用生物素化抗体的 IP 实验，可以使用链霉亲和素珠子偶联物代替蛋白 A 或蛋白 G 珠子。当靶标蛋白接近 25 千道尔顿 (kDa) 抗体轻链或 50 kDa 重链时，这种免疫沉淀程序可能有利于蛋白质印迹分析，这种现象称为抗体掩蔽。或者，可以使用与抗生物素抗体结合的珠子。如果强的生物素-链霉亲和素结合阻止靶标蛋白的充分释放，从而影响后续的检测/分析，这种选择会很有优势。

浏览用于 IP 的生物素化抗体

裂解缓冲液的选择

为了获得最佳结果，我们建议使用新鲜制备的裂解物。如果无法做到这一点，则裂解物可在 -20^°C 下保存最多一个月，或在 -80^ºC 下保存最多一年。请注意，对冻融循环的敏感性因蛋白质而异。对于天然单蛋白 IP 或 co-IP，建议在裂解缓冲液中添加蛋白酶抑制剂和/或磷酸酶抑制剂，以分别保持靶标丰度和磷酸化状态。

IP 类型	推荐的裂解缓冲液
来自细胞样品的天然单蛋白 IP 或 co-IP	细胞裂解缓冲液
来自组织样品的天然单蛋白 IP 或 co-IP	RIPA 缓冲液
Co-IP 需要在较温和的条件下进行，以保持蛋白质-蛋白质的相互作用	Chaps 细胞提取缓冲液
变性、单蛋白 IP	SDS 缓冲液

IP 的对照

在 IP 实验中，使用对照是确保结果正确解读的重要环节，同时也有助于实验的优化和问题的解决。CST 建议在每个 IP 实验中包括三个对照：输入对照、同型对照和单一珠对照。对于蛋白质印迹分析，对照在蛋白质凝胶上的相邻泳道上运行。

输入对照

应纳入完整裂解物对照，以确保实验的蛋白质印迹部分正常工作。如果完整裂解物对照中见到靶标信号，但 IP 样品中未见，则表明抗体工作正常，但是，IP 富集可能失败。

同型对照

同型对照是实验中必要的阴性对照。IP 实验中使用的同型对照应匹配一抗的 IgG 亚类。兔只有一个 IgG 亚类，因此选择同型对照相对简单。我们建议 Normal Rabbit IgG #2729 用于采用兔多克隆抗体的实验，及Rabbit (DA1E) mAb IgG XP^® Isotype Control #3900 用于采用兔单克隆抗体的实验。

当使用小鼠中产生的一抗时，同型对照选择更复杂，因为小鼠有五个 IgG 亚类：IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c、IgG3。具体 CST 抗体的亚类可在来源/同种型部分中产品网页上找到。CST 提供以下同型对照匹配我公司小鼠一抗：

• Mouse (G3A1) mAb IgG1 Isotype Control #5415
• Mouse (E5Y6Q) mAb IgG2a Isotype Control #61656
• Mouse (E7Q5L) mAb IgG2b Isotype Control #53484
• Mouse (E1D5H) mAb IgG3 Isotype Control #37988

同型对照应浓度匹配，并在蛋白质印迹法期间与一抗样品并排运行。

单一珠对照

单一珠对照在 IP 实验中充当珠子的附加阴性对照，并且涉及将珠子添加到没有任何抗体存在的裂解物样品中。如果您在 IgG 同型阴性对照和/或 IP 实验中遇到非特异性结合，可能需要添加单一珠对照。

可选：未结合部分

可以将未结合的蛋白部分与免疫沉淀的蛋白进行比较，以确定 IP 反应的效率，同时，这也是解决问题的一种方法，可以指示靶标蛋白是否未结合抗体-珠子复合物。通过离心或磁分离第一次将珠子沉淀后，可以将含有未结合靶标蛋白部分的上清液储存在 -20^°C 下以进行可选分析。

用于基于质谱分析的 IP 样品制备

液相色谱-质谱 (LC-MS/MS) 或免疫基质辅助激光解吸/电离（ImmunoMALDI 或 iMALDI）的 IP 实验准备遵循与 WB 分析相同的 IP 实验步骤，但最后部分有以下不同之处。

ImmunoMALDI 分析的准备

在 Native IP 实验步骤的 C 部分中，从最后的珠子沉淀物中除去上清液后，

1. 在 5-10 μl MALDI 洗脱缓冲液（50% 乙腈、0.15% 三氟乙酸 (TFA)、10 mg/ml CHCA 基质）中重悬微珠子沉淀物。
2. 在室温下孵育 15 分钟。
3. 将 1 µl 洗脱的分析物滴到 MALDI 板上。
4. 让其在工作台上或通风橱中干燥 5-10 分钟，具体取决于环境湿度。
5. 样品干燥后即可进行分析。

 

有关 ImmunoMALDI 质谱分析² 和微阵列格式的 immunoMALDI 方法^3和4数据的更详细指导可在本页末尾的参考资料中找到。

LC-MS/MS 分析准备

首先制备以下缓冲液：

• 变性缓冲液： 50 mM 碳酸氢铵 (NH₄HCO₃) + 0.1% RapiGest（Waters Corporation，按照制造商的实验步骤制备）
• 还原缓冲液： 30 mM DTT（二硫苏糖醇），溶于 50 mM 碳酸氢铵 (NH₄HCO₃)。
• 烷化缓冲液： 35 mM 碘乙酰胺，溶于 50 mM 碳酸氢铵 (NH₄HCO₃)。
• 胰蛋白酶消化缓冲液： 在 50 mM 碳酸氢铵 (NH₄HCO₃) 中以 1:100 至 1:20（w/w，酶对蛋白质）加入胰蛋白酶。

1. 从 C 部分的最终珠子沉淀物中去除上清液后，将珠子沉淀物重悬于 12.5 μl 变性缓冲液中。
2. 在 90^°C 下的热阻块上孵育 3 分钟，然后将温度降至 50^°C 并孵育 15 分钟。
3. 添加 2.5 μl 还原缓冲液，在 50^°C 下孵育 30 分钟。
4. 添加 2.5 μl 烷化缓冲液，并在室温下避光孵育 30 分钟。
5. 加入 2.5 μl 胰蛋白酶消化缓冲液，并在 37^°C 下孵育 1 小时至过夜。
6. 使用 10% TFA 酸化至 1% TFA，并在 90^°C 下加热 30 分钟。
7. 上样/进样 5-15 μl 样品到仪器上进行 LC-MS/MS 分析。
8. 在适当的蛋白质数据库中进行搜索，使用固定的脲甲基半胱氨酸、可变的氧化、胰蛋白酶消化以及感兴趣的翻译后修饰。

 

如果您的 IP 实验未以按计划进行告终，请访问免疫沉淀法疑难解答指南或联系技术支持。有关蛋白质组学的支持和信息，包括产品、试剂盒和服务，请访问 LC/MS 蛋白质组学资源中心。

参考文献

1. Donnelly DP, Rawlins CM, DeHart CJ, et al. Best practices and benchmarks for intact protein analysis for top-down mass spectrometry. Nat Methods. 2019;16(7):587-594. doi:10.1038/s41592-019-0457-0
2. Li H, Popp R, Frohlich B, Chen MX, Borchers CH. Peptide and Protein Quantification Using Automated Immuno-MALDI (iMALDI). J Vis Exp. 2017;(126):55933. Published 2017 8 月 18 日. doi:10.3791/55933
3. Hamza GM, Bergo VB, Mamaev S, et al. Affinity-Bead Assisted Mass Spectrometry (Affi-BAMS): A Multiplexed Microarray Platform for Targeted Proteomics. Int J Mol Sci. 2020;21(6):2016. Published 2020 3 月 16 日. doi:10.3390/ijms21062016
4. Hamza GM, Miele E, Wojchowski DM, et al. Affi-BAMS™: A Robust Targeted Proteomics Microarray Platform to Measure Histone Post-Translational Modifications. Int J Mol Sci. 2023;24(12):10060. Published 2023 6 月 13 日. doi:10.3390/ijms241210060

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