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免疫沉淀法实验步骤（针对天然蛋白质）

本实验步骤适用于天然蛋白质免疫沉淀法，进行蛋白质免疫印迹分析或激酶活动分析。使用 #73778 Protein A Magnetic Beads 或 #70024 Protein G Magnetic Beads 时，请参阅我们有关使用磁性分离的免疫沉淀实验步骤。

A. 溶液与试剂

注：利用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS)：(#9808) 要制备 1 L 的 1X PBS，将50 ml 20X PBS 加入到 950 ml dH2O 中，并混匀。

  2. 10X 细胞裂解缓冲液：(#9803) 要制备 10 ml 的 1X 细胞裂解缓冲液，将 1 ml 10X 细胞裂解缓冲液加入到 9 ml dH2O 中，并混匀。

    注：使用前，立刻加入 1 mM PMSF (#8553)。

  3. 3X SDS 样品缓冲液：Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) ；通过添加 1/10 体积的 30 X DTT 至 1 体积的 3 X SDS 上样缓冲液，制备新鲜的 3 X 还原上样缓冲液。

  4. Protein A 或 G 琼脂糖珠（针对非偶联的一抗）：使用蛋白 A (#9863) 和蛋白 G (#37478) 分别进行兔 IgG 免疫沉淀和小鼠 IgG 免疫沉淀。

  5. 固定的链霉亲和素（偶联珠子）（针对生物素化抗体）：(#3419) 轻柔涡旋振荡小瓶，并在每次免疫沉淀法中使用 10 µl。
  6. 10X 激酶缓冲液（激酶测定）：(#9802) 要制备 1 ml 的 1X 激酶缓冲液，将 100 µl 10X 激酶缓冲液加入到 900 µl dH2O 中，并混匀。
  7. ATP (10 mM) （激酶测定）：(#9804) 要制备 0.5 ml 的 ATP (200 µM)，将 10 µl ATP (10 mM) 加入到 490 µl 1X 激酶缓冲液中。

B. 制备细胞裂解物

  1. 吸干培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基，使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 在非变性条件下收集细胞，去除培养基后用冰预冷的 1X PBS 洗涤细胞一次。
  3. 去除 PBS，每块平板 (10 cm) 添加 0.5 ml 冰冷的 1X 细胞裂解缓冲液，平板放在冰上孵育 5 分钟。
  4. 从板上刮下细胞，把提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  5. 在冰上进行 3 次超声破碎，每次 5 秒。
  6. 在 4°C，在 14,000 x g 条件下，微量离心 10 分钟，将上清转移到新管中。上清液即为细胞裂解物。如有必要，裂解物可保存在 –80°C。

C. 免疫沉淀法

细胞裂解物预清除（对于非接合和生物素化抗体为可选步骤。）

重要事项：强烈建议使用相应的同型对照，以便在你的一抗免疫沉淀中显示特异性结合。把 Normal Rabbit IgG #2729 用于多克隆一抗，把 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900 用于兔单克隆一抗，把 Mouse (G3A1) mAb IgG1 Isotype Control #5415 用于小鼠 IgG1 单克隆一抗，把 Mouse (E5Y6Q) mAb IgG2a Isotype Control #61656 用于小鼠 IgG2a 单克隆一抗，把 Mouse (E7Q5L) mAb IgG2b Isotype Control #53484 用于小鼠 IgG2b 单克隆一抗，Mouse (E1D5H) mAb IgG3 Isotype Control #37988 用于小鼠 IgG3 单克隆一抗。同型对照的浓度应匹配，并与一抗样品同时进行。

  1. 向浓度为 1 mg/ml 的 200 μl 细胞裂解物中添加 20 μl 蛋白 A (#9863) 或蛋白 G (#37478) 琼脂糖 50% 珠浆、10 μl Streptavidin (Sepharose® Bead Conjugate #3419) 进行生物素化抗体检测。
  2. 在 4°C 下，旋转孵育 30-60 分钟。
  3. 4°C 条件下微量离心 10 分钟。将上清转移到新管中。
  4. 根据所使用的一抗，继续下述其中一项的具体步骤。

使用非偶联的一抗

  1. 将一抗（按产品数据表中建议的合适稀释比例）添加到 200 µl 细胞裂解物中。轻柔震荡下 4°C 过夜孵育。
  2. 添加蛋白 A (#9863) 或蛋白 G (#37478) 琼脂糖（20 µl 50% 珠浆）。轻轻摇动，并在 4°C 下孵育 1-3 小时。
  3. 4°C 条件下微量离心 30 秒。用 500 µl 的 1X 细胞裂解缓冲液，洗涤沉淀物五次。洗涤间期，保持样品于冰上。
  4. 继续使用蛋白免疫印迹法或激酶活动进行分析（D 部分）。

使用生物素化一抗

  1. 将生物素化抗体（按产品数据表中建议的合适稀释比例）添加到 200 µl 细胞裂解物中。轻柔震荡下 4°C 过夜孵育。
  2. 轻柔混匀固定化的 Streptavidin (Sepharose® Bead Conjugate #3419)，并加入 10 µl 珠浆。轻柔震荡下，在 4°C 孵育 2 小时。
  3. 4°C 条件下微量离心 30 秒。用 500 µl 的 1X 细胞裂解缓冲液，洗涤沉淀物五次。洗涤间期，保持样品于冰上。
  4. 继续使用蛋白免疫印迹法或激酶活动进行分析（D 部分）。

使用固定化的抗体 (Sepharose® Bead Conjugate)

  1. 轻轻混合，并添加固定的微珠接合物 (10 µl) 到浓度为 1 mg/ml 的 200 µl 细胞裂解物中。轻柔震荡下 4°C 过夜孵育。
  2. 4°C 条件下微量离心 30 秒。用 500 µl 的 1X 细胞裂解缓冲液，洗涤沉淀物五次。洗涤间期，保持样品于冰上。
  3. 继续使用蛋白免疫印迹法或激酶活动进行分析（D 部分）。

使用固定化的抗体 (磁珠偶联)

  1. 轻轻混合，并加入偶联固定化的珠子 (10 µl) 到浓度为 1 mg/ml 的 200 µl 细胞裂解物中。轻柔震荡下 4°C 过夜孵育。
  2. 将试管放在磁性分离架（#7017 或 #14654）上使磁珠沉淀，并等待 1 - 2 分钟，直至溶液变得澄清。用 500 µl 的 1X 细胞裂解缓冲液，洗涤沉淀物五次。洗涤间期，保持样品于冰上。
  3. 继续使用蛋白免疫印迹法或激酶活动进行分析（D 部分）。

D. 样品分析

继续下述其中一项的具体步骤。

注：勿离心磁珠。应使用磁性分离架（#7017 或 #14654）。

用蛋白免疫印迹法进行分析

  1. 在 20-40 µl 3X SDS 样品缓冲液中重悬沉淀物。涡旋振荡，然后再微量离心 30 秒。
  2. 将样品加热至 95–100°C 并持续 2-5 分钟，然后在 14,000 x g 下瞬时离心 1 分钟。
  3. 将样品 (15-30 µl) 上样到 SDS-PAGE 凝胶上。
  4. 用蛋白质印迹法分析样品（请参阅蛋白质免疫印迹法实验步骤）。

注：对于分子量接近 50 kDa 的蛋白，我们建议使用 Mouse Anti-rabbit IgG (Light-Chain Specific) (D4W3E) mAb (#45262) 或 Mouse Anti-rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678) 作为二抗，以将变性重链产生的遮盖作用减到最小。对于分子量接近 25 kDa 的蛋白，建议使用 Mouse Anti-rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678) 或 Mouse Anti-rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (HRP Conjugate) (#5127)。

用激酶活性测定法进行分析

  1. 用 500 µl 1X 激酶缓冲液洗涤沉淀物两次。置于冰上。
  2. 在 40 µl 1X 激酶缓冲液中悬浮沉淀物，并补充 200 µM ATP 和适当的底物。
  3. 30°C 条件下孵育 30 分钟。
  4. 用 20 µl 3X SDS 样品缓冲液终止反应。涡旋振荡，然后再微量离心 30 秒。
  5. 将含有磷酸化底物的上清转移到另一管中。
  6. 将样品加热至 95–100°C 并持续 2-5 分钟，然后在 14,000 x g 下瞬时离心 1 分钟。
  7. 将样品 (15-30 µl) 上样到 SDS-PAGE 凝胶上。

发布​时间 2008 年 12 月

修订时间 2021 年 4 月

如有任何问题，请联系我们。

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