蛋白质印迹法实验步骤

蛋白印迹实验 (WB) 广泛用于分析细胞或组织提取物中的特异性蛋白表达。在 Cell Signaling Technology (CST)，我们知晓蛋白印迹实验很耗时，而且它们的成功对您的研究进展有着重要影响。为此，我们在开发抗体时深思熟虑，提供优化的实验步骤以及参考信息和技术支持，以使您的蛋白印迹实验获得成功。

对于蛋白质印迹法，将膜与使用 5% w/v BSA 或脱脂奶粉的 1X TBS、0.1% Tween 20 稀释的一抗在 4°C 下孵育过夜，同时轻轻振摇。

使用 Cell Signaling Technology 蛋白质印迹法实验步骤的理由

注：请参阅一抗产品网页，了解推荐的一抗稀释缓冲液和抗体稀释度。

A. 溶液与试剂

从样品制备到检测，您进行蛋白质印迹法时所需要的试剂现均包含在一个便利的试剂盒中：#12957 Western Blotting Application Solutions Kit

了解我们的溶液与试剂

注：利用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS)：( #9808) 为了制备 1 L 1 X PBS：添加 50 ml 20 X PBS 至 950 ml dH₂O，然后将其混匀。
2. 10X Tris 盐缓冲液 (TBS)：( #12498) 要制备 1 L 1X TBS：向 900 ml dH₂O 中添加 100 ml 10X，然后混匀。
3. 1X SDS 样品缓冲液：Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) ；通过添加 1/10 体积的 30 X DTT 至 1 体积的 3 X SDS 上样缓冲液，制备新鲜的 3 X 还原上样缓冲液。用 dH₂O 稀释至 1X。
4. 10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液：( #4050) 要制备 1 L 1X 电泳缓冲液：向 900 ml dH₂O 中添加 100 ml 10X 电泳缓冲液，然后混匀。
5. 10X Tris-Glycine 转移缓冲液：( #12539) 要制备 1 L 1X 转移缓冲液：向 200 ml 甲醇 + 700 ml dH₂O 中添加 100 ml 10X 转移缓冲液，然后混匀。
6. 10X Tris Buffered Saline with Tween 20 (TBST)：( #9997) 要制备 1 L 1X TBST：向 900 ml dH₂O 中添加 100 ml 10X TBST，然后混匀。
7. 脱脂奶粉：(#9999)。
8. 封闭缓冲液：含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST；要制备 150 ml，向 150 ml 1X TBST 中添加 7.5 g 脱脂奶粉并充分混匀。
9. 洗涤缓冲液：(#9997) 1X TBST。
10. 牛血清白蛋白 (BSA)：(#9998)。
11. 一抗稀释缓冲液：含 5% BSA 或 5% 脱脂奶粉的 1X TBST（如一抗产品网页所示）；如要制备 20 ml，往 20 ml 1X TBST 中添加 1.0 g BSA 或脱脂奶粉，并充分混匀。
12. 生物素化的蛋白分子量标准品检测包：(#7727)。
13. Blue Prestained Protein Marker, Broad Range (11-250 kDa)：(#59329)。
14. 印迹膜和纸：(#12369) 本实验步骤已针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常推荐 0.2 µm 孔径。
15. HRP 偶联二抗：抗兔 (#7074)；抗小鼠(#7076)。
16. 检测试剂：LumiGLO 化学发光试剂和过氧化物 (#7003) 或 SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。

B. 蛋白质印迹

制备样品的常规流程。

样品制备、SDS-PAGE 和转移

1. 添加含有调节因子的新鲜培养基，使其对细胞进行处理一段时间。
2. 从培养物中吸出培养基；用 1X PBS 洗涤细胞；吸出。
3. 加入 1X SDS 样品缓冲液（6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径的平板 500 µl）来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
4. 超声处理 10–15 秒以完成细胞裂解并剪切 DNA（以降低样品粘度）。
5. 取 20 µl 样品，在 95–100°C 下加热 5 分钟；放在冰上冷却。
6. 微量离心机内离心 5 分钟。

7. 上样 20 µl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。

   注：建议将预染蛋白分子量标准品（#59329，5 µl/泳道）上样以验证电转移和将生物素化的蛋白质分子量标准品 (#7727，10 µl/泳道）上样以确定分子量。

8. 电转至硝酸纤维素膜 (#12369)。

C. 膜封闭和抗体孵育

封闭和抗体孵育

注：容量适用于 10 cm x 10 cm (100 cm²) 的膜；对于不同尺寸的膜，请相应调整容量。

I. 膜封闭

1. （可选）转移之后，在室温下用 25 ml TBS 将硝酸纤维素膜洗涤 5 分钟。
2. 将膜置于 25 ml 封闭缓冲液中，在室温下孵育 1 小时。
3. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。

II. 一抗孵育

根据所使用的一抗，继续下述其中一项的具体步骤。

对于无偶联的一抗

1. 将膜和一抗（按照产品说明书中建议的适当稀释度和稀释液）置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。
2. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
3. 按一抗来源选取合适的 HRP 偶联的二抗（#7074 或 #7076，按 1:2000），同时加入anti-biotin, HRP-linked Antibody（#7075 ，按 1: 1000-1:3000）以检测生物素化的蛋白质标准品。置于 10 ml 封闭缓冲液中孵育 1 小时并不时轻轻搅动。
4. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
5. 继续进行检测（D 部分）。

对于偶联有HRP 的一抗

1. 将膜和一抗（按照产品数据表中建议的适当稀释度）置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。
2. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
3. 如检测生物素化蛋白标准品，使用 Anti-biotin, HRP-linked Antibody （#7075 ，按 1:1000-1:3000）在室温下于 10 ml 封闭缓冲液中孵育 1 小时并不时轻轻搅动。
4. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
5. 继续进行检测（D 部分）。

对于生物素化的一抗

1. 将膜和一抗（按照产品数据表中建议的适当稀释度）置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。
2. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
3. 将膜与 Streptavidin-HRP （#3999 以适宜的稀释度）在室温下于 10 ml 封闭缓冲液中孵育 1 小时并不时轻轻晃动。
4. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
5. 继续进行检测（D 部分）。

请勿加入用于检测生物素化蛋白标准品的 Anti-biotin, HRP-linked Antibody。没有必要。Streptavidin-HRP 也将会使生物素化标准品可视化。

D. 蛋白质检测

蛋白质检测

1. 将膜与 10 ml LumiGLO（0.5 ml 20X LumiGLO #7003、0.5 ml 20X 过氧化物和 9.0 ml 净化水）或 10 ml SignalFire™ #6883（5 ml 试剂 A，5 ml 试剂 B）在室温下孵育 1 分钟，并不时轻轻搅动。

2. 将膜上多余的显影液沥干（勿令其干燥），包裹在塑料膜中，然后用 X 射线胶片曝光。从刚开始的 10 秒曝光结果中可以看出适当的曝光时间。

   注：由于检测反应的动力学特征，在孵育后信号立即变得最强，但在随后的 2 小时内会减弱。