有时，单细胞数据集中出现双联体和多重联体会影响 FeaturePlot 中蛋白质可视化结果的准确性。使用最大截止值（max.cutoff）可以绕过观察到来自异常值的高蛋白质表达水平，从而实现清晰的可视化。针对此参数使用较大的值，例如“q90”或更高（“q95”、“q99”等），根据您的实验需要进行选择。参见以下粗体示例：
FeaturePlot(object, features = c("protein_Phospho-S6(Ser235-236)-Ab"), max.cutoff = “q90”, min.cutoff = "q5")
阅读已发表的文献和挖掘公共数据库也很重要，以确保您的蛋白质在您的样本中表达，并了解哪些条件可能改变这种表达。
如果使用未经 InTraSeq 验证的抗体，抗体结合不足可能会影响可视化结果的准确性。在单细胞实验中使用 CST® InTraSeq 验证的抗体，并精确遵循 InTraSeq 实验步骤，以确保结果可靠且可重现。
许多信号转导通路靶标普遍表达，可在多种细胞类型中检测到。在分析和解释信号转导通路数据时，确保在实验设计中包含适当的对照（敲下、敲除、刺激、抑制等）。
在 FeaturePlot 中使用颜色渐变有助于促进单细胞信号转导通路数据的分析和解释。请参见下面的粗体示例，使用蓝色（低表达）、灰色（中等表达）和红色（高表达）：
FeaturePlot(your_object, features = c("protein_Phospho-CREB(Ser133)-Ab"), max.cutoff = "q95", min.cutoff = "q5") + scale_color_gradientn(colours = c("#003C7B", "#73A9D2", "grey90", "#FDB393", "#b22222"))
CST 科学家严格验证所有 InTraSeq 试剂和实验步骤，以确保一致且稳健的 RNA 保存。使用经 InTraSeq 验证的试剂可获得高质量的 RNA 测序结果并保留细胞异质性。InTraSeq 抗体偶联物和实验步骤经过开发和验证，可用于甲醇固定，遵循 InTraSeq 实验步骤时效果最佳。
我们设计并验证了与 10x Genomics Chromium 平台配合使用的 InTraSeq 试剂和实验步骤。完成 InTraSeq 实验步骤后，科学家应使用具有特征条形码技术的 10x Genomics Chromium Single Cell 3' Kits。有关详细信息，请参阅相应的用户指南：CG000317、CG000206 或 CG000732。
我们为 CST 一抗提供广泛的定制偶联和标记服务，包括用于单细胞分析的服务。
值得注意的是，带有寡核苷酸的定制标记抗体尚未经过验证，无法与 InTraSeq 试剂一起使用。客户需要自行正确滴定和验证任何定制偶联抗体是否可用于 InTraSeq 技术。
欲了解更多详情，请访问定制偶联和标记服务网页，或联系当地销售部门。
添加甲醇固定缓冲液的速率会影响细胞聚集。在细胞固定（第 1 天）- InTraSeq 实验步骤的步骤 7 中，在至少 60 秒的时间内分配甲醇非常重要。如果不这样做，可能会产生双重/多重的结果。
如果在清洗和计数（第 3 天）后仍然观察到细胞团 - InTraSeq 实验步骤的步骤 8，建议在进行单细胞实验之前进行额外的移液管混合。
开始步骤 B 时，封闭（第 2 天）并持续到实验步骤结束，以 850 x g（非 RPM）离心至关重要。较低速度离心将导致细胞损失。
此外，从步骤 C：免疫染色（第 2 天）开始，必须确保细胞沉淀物在需要去除和丢弃上清液的每个步骤中浸入约 40 μL 的液体中。尝试丢弃所有上清液将导致细胞损失。
虽然可以在 InTraSeq 实验之前用偶联抗体或hashing试剂染色活细胞，但不建议这样做。由于在使用 InTraSeq 试剂时，抗体的结合特性表现不同，因此我们强烈建议不要在步骤 C：免疫染色（第 2 天）中使用经非 InTraSeq 验证的 3’偶联物。
如果在 InTraSeq 3’ 实验步骤之前进行免疫染色步骤，我们强烈建议使用至少 200 万个细胞开始免疫染色，以保证步骤 1 中有足够数量的细胞。
InTraSeq 蛋白质库的读取数至少应为每个细胞 5,000 个读数。
混合物中的每种抗体都经过滴定，以保证 InTraSeq 检测中信号强劲且背景最小。
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