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InTraSeq™ 3' 实验步骤

为获得最佳效果：

  • 保持无 RNase 且无菌的工作空间。
  • 强烈建议使用带有过滤器的移液器枪头。
  • 在开始 B.阻断（第 2 天）直至实验步骤结束时，以 850 x g（非 RPM）进行离心至关重要。
  • 在开始实验步骤中的 C. 部分免疫染色（第 2天）时，在去除和丢弃上清液时，保持细胞沉淀物浸没在液体中（约 40 µL）至关重要。
  • 在任何步骤中丢弃上清液时请勿使用真空抽吸；务必使用移液器。
  • 确保试剂在使用前完全解冻。

注意：

  • CST 在采用特征条形码技术的 10x Genomics Chromium Single Cell 3' Kits 中验证了所有 InTraSeq™ 3'的检测试剂盒组分。
  • 安全停止 - 如果需要停止，这是实验步骤中的一个安全停止点。
  • 该实验步骤专为单个 InTraSeq™ 检测（一个样品）而设计。如果处理多个样品，则应按比例调整所有数量。

溶液和试剂

试剂盒中包含的材料（储存在 -20°C 下）

  • InTraSeq™ Blocking Buffer A #10471
  • InTraSeq™ Blocking Buffer B #31701
  • InTraSeq™ Staining Buffer #46005
  • InTraSeq™ Wash Buffer #59335
  • InTraSeq™ Reducing Agent #63760
  • InTraSeq™ RNase Inhibitor #79298
  • Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control (InTraSeq™ 3' Conjugate 3000) #81472
  • Histone H3 (D1H2) XP® Rabbit mAb (InTraSeq™ 3' Conjugate 3002) #68984

不包括所要求的试剂

  • InTraSeq™ 3' 偶联物/抗体混合物
  • 两个无菌 40 微米 Falcon 细胞过滤器
  • 涡旋混合器
  • 1.5 mL 无菌聚丙烯微量离心管 - LoBind
  • 15 mL 锥形无菌聚丙烯离心管（首选 LoBind）
  • 50 mL 锥形无菌聚丙烯离心管（首选 LoBind）
  • Phosphate Buffered Saline (PBS-1X) pH7.2 (Sterile) #9872
  • Methanol #13604

在开始之前：

（可选）收到试剂盒后，请解冻并用移液器混合 InTraSeq™ 封闭缓冲液 A，然后将 870 µL 分装到 8 个单独的 1.5 mL 无菌微量离心管中。

A. 细胞固定（第 1 天）

注：如果在此实验步骤之前执行免疫染色步骤，我们强烈建议使用至少 200 万个细胞开始免疫染色，以保证在下面的步骤 1 中达到 100 万到 500 万个细胞。

  1. 计数 100 万到 500 万个细胞并将其转移到一个 15 mL 管中。

    注：如果细胞数量少于 100 万个，请勿继续执行该实验步骤。

  2. 细胞在 4°C 下以 300 x g 的离心力离心分离 5 分钟。
  3. 取出并丢弃上清液，然后用 10 mL 冰冷的 1X PBS 洗涤细胞。
  4. 细胞在 4°C 下以 300 x g 的离心力离心分离 5 分钟。
  5. 取出并丢弃上清液，不要扰动细胞沉淀物，然后将细胞悬浮在 0.5 mL 冰冷的 1X PBS 中。
  6. 打开涡旋混合器，以低速（~速度 1-4，取决于混合器）将其保持在“开启”状态（而非“自动/触摸”模式）。样品不应涡旋，而应不断混合。 如果混合器的速度足够快以使样品涡旋，则相应降低速度。

    注：在以下步骤中，缓慢（＞30 秒）滴落冰冷的甲醇非常重要。

  7. 将 15 mL 试管置于涡旋混合器上，同时保持“开启”状态，然后逐滴缓慢添加 4.5 mL 冰冷的甲醇（＞30 秒）。
  8. 在 -20°C 冷冻箱中孵育细胞过夜。（安全停止 - 样品可在 -20°C 冰箱中储存长达 7 天）

B. 封闭（第 2 天）

从这时起，在每个离心步骤中，以 850 x g 的离心力对细胞进行离心至关重要。降低离心速度将导致细胞损失。

  1. 在室温下解冻以下试剂：
    • 解冻 1 瓶 InTraSeq™ Wash Buffer。
    • 解冻 InTraSeq™ Blocking Buffer B。
    • 解冻并用移液器混合 InTraSeq™ Blocking Buffer A。
    • 解冻并涡旋混合 InTraSeq™ Reducing Agent，直至沉淀消失。
  2. 解冻后，将试剂放在冰上。
  3. 准备加热/冷却的 InTraSeq™ Blocking Buffer B：
    1. 将 130 µL InTraSeq™ Blocking Buffer B 分装到无菌 1.5 mL 微量离心管中。将库存 InTraSeq™ Blocking Buffer B 放回冰箱。
    2. 将等分试管在 95°C 下加热 5 分钟。
    3. 短暂离心试管，然后将其放在冰上。在以下步骤中使用此加热/冷却的 InTraSeq™ Blocking Buffer B。
  4. 制备 scBlock（见下表），用移液器混合。存放在冰上。
    scBlock 体积
    InTraSeq™ Blocking Buffer A 860 µL
    加热/冷却的 InTraSeq™ Blocking Buffer B 98 µL
    InTraSeq™ Reducing Agent 40 µL
    InTraSeq™ RNase Inhibitor 2 µL
    总体积 1,000 µL
  5. 细胞在 4°C 下以 850 x g 的离心力离心分离 5 分钟。
  6. 取出并丢弃上清液，然后将 scBlock 添加到细胞中。用移液器混合以重新悬浮细胞，然后将细胞放在冰上至少 30 分钟。
  7. 在 scBlock 孵育期间，按如下方式制备抗体预混液：
    1. 根据所使用的 InTraSeq™ 3' 抗体混合物和单个 InTraSeq™ 3' 偶联物（Ind. InTraSeq™ 3' Conj. 或 Ind.Conj.）的数量确定抗体的体积 (Vol. of Abs.) （见下表）。将总体积限制为 30 μL。
        体积
      （仅限Cocktails）      		 体积
      （仅限 Ind. Conj.）      		 体积
      (Cocktails + Ind. Conj.)
      InTraSeq™ 3' Cocktail  5 μL（每种混合物） N/A ___ μL（5 µL 每种混合物）
      Ind. InTraSeq™ 3' Conj. N/A 3 µL (per Ind. Conj.) ___ µL (3 µL per Ind. Conj.)
      抗体体积 ___ µL ___ µL ___ µL
    2. 使用上面计算的抗体体积（最大 30 µL）制备抗体预混液（见下表）。轻轻移液混合以尽量减少气泡形成，然后储存在冰上。
      抗体预混液 体积
      （仅限Cocktails）      		 体积
      （仅限 Ind. Conj.）      		 体积
      (Cocktails + Ind. Conj.)
      抗体体积 ___ µL ___ µL ___ µL
      InTraSeq™ Wash Buffer 30 μL - 抗体体积（见上行）
      InTraSeq™ Staining Buffer 55 µL 55 µL 55 µL
      加热/冷却的 InTraSeq™ Blocking Buffer B 10 µL 10 µL 10 µL
      Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control (InTraSeq™ 3' Conjugate 3000) 3 µL 3 µL 3 µL
      Histone H3 (D1H2) XP® Rabbit mAb (InTraSeq™ 3' Conjugate 3002) 3 µL 3 µL 3 µL
      InTraSeq™ RNase Inhibitor 2 µL 2 µL 2 µL
      总体积 103 µL 103 µL 103 µL
  8. 经过 30 分钟 scBlock 孵育时间后，将 2 mL InTraSeq™ Wash Buffer添加到细胞中并用移液器混合。
  9. 将细胞通过无菌 40 微米 Falcon 细胞过滤器过滤到 50 mL 管中。

    注：为了最大限度地提高细胞回收率，在过滤时对移液管的尖端施加轻微的压力。（参见图片）

    图像 1
  10. 将流过/过滤的细胞转移到新的 15 mL 管中并立即开始 C 部分：免疫染色（第 2 天）。

    注：将剩余的 InTraSeq™ Wash Buffer 储存在 4°C 下，以供第 3 天使用。

C. 免疫染色（第 2 天）

从此时起，每次去除并丢弃上清液时，保持细胞沉淀物浸没在液体中（约 40 µL）至关重要。细胞干燥会对 RNA 信号产生负面影响并导致细胞损失。

  1. 细胞在 4°C 下以 850 x g 的离心力离心分离 5 分钟。
  2. 取出并丢弃上清液，同时在管中保留约 40 µL。
  3. 向细胞中加入 100 μL 抗体预混液。用移液管混合以重悬细胞。
  4. 转移至无菌 1.5 mL LoBind 微量离心管中，并在 4°C 下孵育过夜（约 16 小时）。

    注意：

    • 请勿将细胞孵育超过 20 小时。
    • 在 4°C 下维持过夜孵育至关重要。

D. 洗涤和计数（第 3 天）

在开始之前：

  • 制备改良的 InTraSeq™ Wash Buffer。轻轻混合以尽量减少气泡形成，然后放在冰上。

    注：如果储存瓶中还有剩余的 InTraSeq™ Wash Buffer，请将其储存在 -20°C 下。

    • 图像 2
  1. 将 1 mL 改良的 InTraSeq™ Wash Buffer 加入含有细胞的 1.5 mL 微量离心管中。用移液管混合，然后将混合物转移到 15 mL 试管中。
  2. 添加 2 mL 改良的 InTraSeq™ Wash Buffer，使总体积为 3 mL。
  3. 在 4°C 下以 850 x g 的离心力离心分离 5 分钟。取出并丢弃上清液，同时在管中保留约 40 µL。
  4. 加入 1 mL 改良的 InTraSeq™ 洗涤缓冲液。用移液管混合以重悬细胞，然后加入另一 3 mL 改良 InTraSeq™ 洗涤缓冲液，使总体积为 4 mL。
  5. 重复步骤“3”和“4”，然后通过无菌 40 微米 Falcon 细胞过滤器将 4 mL 细胞悬液过滤到 50 mL 试管中。将流经/过滤后的细胞转移到新的 15 mL 试管中。

    注：为了最大限度地提高细胞回收率，在过滤时对移液管的尖端施加轻微的压力。（参见图片）

    图像 1
  6. 细胞在 4°C 下以 850 x g 的离心力离心分离 5 分钟。取出并丢弃上清液，同时在管中保留约 40 µL。
  7. 向细胞中加入 100 μL 改良的 InTraSeq™ Wash Buffer。用移液管混合以重悬细胞，然后将细胞置于冰上。

    注：从此时起，将细胞保存在改良的 InTraSeq™ Wash Buffer中，包括任何必要的稀释。使用任何其他缓冲液或溶液都会导致 RNA 降解。

  8. 对细胞进行计数。请参阅具有特征条形码技术的 10x Genomics Chromium Single Cell 3' Kits 实验步骤中的细胞悬浮体积计算器表，来确定所需的细胞浓度。

    重要事项：仅使用改良的 InTraSeq™ 洗涤缓冲液稀释细胞，以达到所需的细胞浓度。

    注：如果计数后观察到细胞团块，建议在进行单细胞实验之前使用移液器进行额外的混合。

  9. 使用具有特征条形码技术的 10x Genomics Chromium Single Cell 3' Kits 处理细胞。

仅供研究使用。不得用于诊断流程。

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