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CAR-工程化细胞检测解决方案

基于嵌合抗原受体 (CAR) 的细胞疗法的开发正在彻底改变人类癌症和自身免疫性疾病的治疗。随着这种创新的治疗方式不断改进并变得更加容易获得，更好的试剂正在提高我们检测、识别和充分检测 CAR 表达细胞的能力。凭借不断增长的创新产品组合，CST 正在帮助推进该领域研究人员的工作。

更轻松、更快速地检测 CAR 工程化细胞

科学家在开发和检测 CAR 工程化细胞时面临的最大挑战之一是需要强大、灵敏且有选择性的研究试剂来识别 CAR 工程化细胞。如果您计划在研究中使用免疫检测，那么开发自己的抗独特型抗体来识别 CAR 工程化细胞可能会是一个漫长且耗费资源的过程。

用于检测 CAR 工程化细胞的工作流程解决方案

检测 CAR 工程化细胞的复杂过程有许多阶段。CST 专注于该过程中的一个关键步骤，并开发了一套专门用于 CAR 细胞检测的研究工具。

检测

分析

定量

纯化
步骤 1 步骤 2 步骤 2 步骤 2

评估 CAR 和靶抗原表达

探究免疫细胞的激活、增殖、活力和信号转导

测定细胞表面 CAR 表达密度或 CAR 转基因的转导效率

使用基于珠子或基于 FACS 的分选来富集 CAR+ 细胞

为了简化您的分析，CST 科学家针对基于 scFv 的 CAR 普遍存在的肽接头序列开发了重组单克隆抗体。通过靶向这些普遍存在的接头序列，您可以消除对所测试的每个 CAR 变体的抗独特型抗体的需求，从而显著减少时间、精力和成本。我们的 CAR Linker抗体对 G4S 或 Whitlow/218 接头具有高度特异性，因此可以检测基于 scFv 的 CAR 表达，而不依赖于 scFv 的特异性。

视频：以通用、创新性抗体检测 CAR 表达 (2:04)

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CAR 检测

使用 G4S Linker (E7O2V) Rabbit mAb (PE Conjugate)（实线）或浓度匹配的 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control (PE Conjugate) #5742（虚线），对活性 Jurkat 细胞（蓝色，阴性）或经工程化以稳定表达含有 G4S Linker 的基于 scFv 的抗 CD20 CAR 的 Jurkat 细胞（绿色，阳性）进行流式细胞分析。细胞系由匹兹堡大学 Lohmueller 实验室提供。

对照

将 Whitlow/218 Linker Posibeads™ 对照添加到含有野生型 Jurkat 细胞和经过工程化以表达含有 Whitlow/218 接头的基于 scFv 的抗 CD19 CAR 的 Jurkat 细胞的混合活细胞群中。然后用 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control (Alexa Fluor® 488 Conjugate) #2975（中图）或 Whitlow/218 Linker (E3U7Q) Rabbit mAb (Alexa Fluor® 488 Conjugate) #55809（右图）对细胞和 Posibeads 对照进行免疫染色。如图所示（左图），细胞和珠子通过前向散射 (FSC) 和侧向散射 (SSC) 进行区分，并且两种免疫染色条件下的细胞 (蓝色) 和 Posibeads 对照 (绿色) 的荧光数据 (FL1) 均显示。CAR 细胞系由匹兹堡大学 Lohmueller 实验室提供。

靶标抗原检测

使用 CD19 (Intracellular Domain) (D4V4B) XP® Rabbit mAb #90176 对石蜡包埋的人淋巴瘤组织进行免疫组织化学分析。

使用 TNFRSF17/BCMA (E6D7B) Rabbit mAb #88183 对石蜡包埋的人正常结肠组织进行免疫组织化学分析。

在 Leica BOND Rx 上，使用 Claudin-6 (E7U2O) XP® Rabbit mAb #18932 对石蜡包埋的人卵巢浆液性乳头状癌组织进行免疫组织化学分析。

T 细胞激活

使用 Phospho-SLP-76 (Ser376) (E3G9U) XP® Rabbit mAb (Alexa Fluor® 488 Conjugate) #47876（上行）或浓度匹配的 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control (Alexa Fluor® 488 Conjugate) #2975（下行）和共染色的 CD3 (17A2) Rat mAb (APC Conjugate) #24265，对未经处理（左栏）或经 Rapid-Act T-Cell Activation Kit #86772 (Mouse, Anti-CD3/CD28)（15 分钟；右栏）处理的小鼠脾细胞进行流式细胞分析。

细胞增殖

在 4 天（d0-d3）的过程中跟踪 Jurkat 活细胞的细胞分裂。将细胞在第 0 天用 Cell Proliferation Tracer Kit (Fluorometric, Violet 450) #48444 标记，并每天通过流式细胞术分析。每个相继较暗的峰代表一个细胞分裂。未染色的细胞由无阴影峰表示。

细胞毒性分析

使用含有 10% FBS 的培养基，将 HeLa 细胞以不同密度接种到 96 孔板中。孵育过夜后，用无血清培养基替换细胞，然后用测定缓冲液（自发 LDH 释放）或 10% Triton X-100 溶液（最大 LDH 释放）处理。处理后，除去培养基并放入新的 96 孔板中。使用 LDH Cytotoxicity Assay Kit #37291 实验步骤确定释放到培养基中的 LDH 量。

通过流式细胞术进行免疫表型分析

使用 Phospho-SLP-76 (Ser376) (E3G9U) XP® Rabbit mAb (PE Conjugate) #76143（上行）或浓度匹配的 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control (PE Conjugate) #5742（下行）和共染色的 CD3 (UCHT1) Mouse mAb (FITC Conjugate) #86774 对未经处理（左栏）或已经过交联抗 CD3 + 抗 CD28（各 10 μg/ml，15 分钟；右栏）处理的人外周血单核细胞进行流式细胞分析。

与浓度匹配的 Mouse (MOPC-21) mAb IgG1 Isotype Control (violetFluor 450 Conjugate) #40282（虚线）比较，使用 CD3 (UCHT1) Mouse mAb (violetFluor 450 Conjugate) #61347（实线）对活性人外周血单核细胞进行流式细胞分析。

CAR-T 细胞激活的下游信号转导解析
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监测 CAR 转导效率

以浓度匹配的 Mouse (MOPC-21) mAb IgG1 Isotype Control (FITC Conjugate) #97146（虚线）作为对照，使用 CD4 (RPA-T4) Mouse mAb (FITC Conjugate)（实线）对活的人外周血单核细胞进行流式细胞分析。

基于微珠的 CAR+ 细胞分选

使用生物素化的 G4S Linker (E7O2V) Rabbit mAb 对输入（左图）和富集后（右图）中的活性细胞进行流式细胞分析，以进行富集。输入由 CD4+/CD8+ 人 T 细胞组成，其中包含未转导细胞的混合物和用含有 G4S Linker 的基于 scFv 的抗 CD20（Leu16）CAR 转导的细胞。富集后样本显示在细胞表面表达 CAR 的细胞群几乎纯净。Anti-rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 647 Conjugate) #4414 用作二抗，以检测生物素化抗体。

基于 FACS 的 CAR+ 细胞分选

使用 Whitlow/218 Linker (E3U7Q) Rabbit mAb (PE Conjugate) #62405（右图）或浓度匹配的 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control (PE Conjugate) #5742（左图），对活性泛 CD3+ T 细胞进行流式细胞分析，这类细胞分离自人 PBMC 并经工程化以表达含有 Whitlow/218 Linker 的基于 scFv 的抗 CD19 CAR。标签蓝色荧光蛋白 (TagBFP) 与 CAR 共表达。数据由 Lohmueller 实验室（匹兹堡大学）的 Michael Kvorjak 提供。

用于转化研究的组织学工具

在利用 CAR 工程化细胞治疗实体瘤时，科学家想要回答的一个最重要的问题是，它们的治疗细胞是否进入了肿瘤微环境。最常用的方法包括使用定制的抗独特型抗体或 RNA ISH，但这两种方法都有明显的缺点。现在可以使用市售抗体直接检测实体肿瘤中的 CAR 表达。

研究组织中的 CAR 表达

使用 Whitlow/218 Linker (F2G3S) Rabbit mAb #47414 对输注了原代人抗 CD19 CAR-T 细胞（左）或 PBS 对照（右）的 NSG 小鼠脾脏中的 Raji B 细胞淋巴瘤异种移植物进行免疫组织化学分析。

探究肿瘤微环境

使用 FAP (F1A4G) Rabbit mAb #52818 对石蜡包埋的人结肠癌组织进行免疫组织化学分析。

CAR-工程化细胞检测资源

探索不断丰富的网络研讨会、科学海报、应用说明和其他专注于 CAR 细胞检测的资源库。

网络研讨会和视频
用于表征 CAR-T 细胞的新型抗体 (31:47)

了解 CAR Linker 抗体如何探究不同 CAR 的表达。

评估 CAR-T 细胞信号转导和激活的分析工具 (45:23)

了解使用 Bio-Techne 分析仪器和 CST 的抗 CAR Linker 抗体生成 CD19 CAR-T 细胞的简化工作流程。

以通用、创新性抗体检测 CAR 表达 (2:04)

CST 的创新性单克隆Linker抗体无需为开发的每种新嵌合抗原受体 (CAR) 分子研发独特的检测试剂，从而加快流式细胞术检验组合检测。

 

用于检测 CAR-T 细胞的新型抗体

 

评估 CAR-T 细胞信号转导和激活的分析工具

常见问题

G4S Linker (E7O2V) Rabbit mAb 是否可以检测具有单个 G4S 重复序列的基于 scFv 的 CAR？

不可以，E7O2V 与基于 scFv 的 CAR 最佳结合需要两次或更多次 G4S 序列重复。

是否知道 G4S Linker (E7O2V) Rabbit mAb 和 Whitlow/218 Linker (E3U7Q) Rabbit mAb 的 Kd？

可以。G4S Linker (E7O2V) Rabbit mAb 的 Kd 为 ~1–2 nM，而 Whitlow/218 Linker (E3U7Q) Rabbit mAb 的 Kd 为 ~2.5 nM。

你们是否已测试过 G4S Linker (E7O2V) Rabbit mAb 和 Whitlow/218 Linker (E3U7Q) Rabbit mAb 能否与具有不同 Ag 特异性的 scFv 结合？

可以。我们已验证 G4S Linker (E7O2V) Rabbit mAb 可与 4 种不同的 scFv 结合，Whitlow/218 linker 可与 4 种不同的 scFv 结合。

你们是否已测试过 G4S Linker (E7O2V) Rabbit mAb 和 Whitlow/218 Linker (E3U7Q) Rabbit mAb 能否检测 FFPE 组织中的 CAR 工程化细胞？

可以。很遗憾，G4S Linker (E7O2V) Rabbit mAb 和 Whitlow/218 Linker (E3U7Q) Rabbit mAb 都不适合检测 FFPE 组织中的 CAR 工程化细胞。但是，我们推出了已获准用于 FFPE 中的 IHC 的 Whitlow/218 Linker (F2G3S) Rabbit mAb。

你们是否已测试过 G4S Linker (E7O2V) Rabbit mAb 和 Whitlow/218 Linker (E3U7Q) Rabbit mAb 能否用蛋白质印迹法检测细胞提取物中的 CAR？

可以。很遗憾，G4S Linker (E7O2V) Rabbit mAb 和 Whitlow/218 Linker (E3U7Q) Rabbit mAb 都不适合使用常规免疫印迹技术检测细胞提取物中的 CAR 蛋白。不过，Whitlow/218 Linker (E3U7Q) Rabbit mAb 已经过验证可在 Jess Simple Western 平台上使用，Whitlow/218 Linker (F2G3S) Rabbit mAb 已经过验证可用于蛋白质印迹分析。

你们是否已测试过 G4S Linker (E7O2V) Rabbit mAb 和 Whitlow/218 Linker (E3U7Q) Rabbit mAb 能否使用流式细胞术检测固定细胞或固定透化细胞中的 CAR？

可以。G4S Linker (E7O2V) Rabbit mAb 和 Whitlow/218 Linker (E3U7Q) Rabbit mAb 均可在使用活性细胞的流式细胞术检测中检测表面表达的 CAR。不建议在染色前使用固定细胞或固定透化细胞。

你们能提供 FDA 批准的 CAR 构建体中使用的肽接头的具体信息吗？

可以。Yescarta、Tecartus、Breyanzi 和 Abecma 均含有 Whitlow 接头。Kymriah 包含一个 3X-G4S 接头，Carvykti 包含一个 1X-G4S 接头。

使用抗 G4S Linker 抗体进行基于磁珠的 CAR T 细胞纯化
CST 市售的 G4S Linker (E7O2V) Rabbit mAb (PE Conjugate) #38907 促进了这种新的 CAR T 细胞纯化方法的开发。作者观察到在一步法过程中 CAR T 细胞进行了高度富集，且不影响细胞活力，这表明 CST 抗体的特异性和性能使该方法取得了成功。
Harrer DC, Li SS, Kaljanac M, et al. Magnetic CAR T cell purification using an anti-G4S linker antibody. J Immunol Methods. 2024;528:113667. doi:10.1016/j.jim.2024.113667

接头特异性单克隆抗体为基于 scFv 的 CAR NK 细胞提供了一种简单可靠的检测方法
本文证明了 CST Whitlow/218 和 G4S 接头特异性单克隆抗体在检测和分析基于 scFv 的 CAR NK 细胞中的实用性。这些抗体可用于通过流式细胞术在各种实验环境中（包括体外培养、全血样本和肿瘤球体）以高特异性和灵敏度可靠地识别 CAR NK 细胞。此外，该研究还强调了抗体在功能测定和 CAR NK 细胞的正向选择中的作用，展示了它们作为推进 CAR NK 细胞研究和临床应用的多功能工具的有效性。
Schindler K, Ruppel KE, Müller C, Koehl U, Fricke S, Schmiedel D. Linker-specific monoclonal antibodies present a simple and reliable detection method for scFv-based CAR NK cells. Mol Ther Methods Clin Dev. 2024;32(3):101328. 2024 8 月 22 日. doi:10.1016/j.omtm.2024.101328

合成免疫检查点接合剂可保护 HLA 缺陷型 iPSC 及其衍生物免受先天免疫细胞毒性
本文探讨了合成免疫检查点接合剂的工程设计，以增强 HLA 缺陷型诱导多能干细胞 (iPSC) 及其衍生物的免疫逃避能力。该研究中的一个关键实验涉及使用 CST 生物素化的 G4S Linker F(ab')2 片段来评估表面表达和潜在的调节作用。抗体片段可以对表达水平和相互作用进行详细的流式细胞分析，突出了它们在优化免疫逃避策略中的实用性。
Gravina A, Tediashvili G, Zheng Y, et al. Synthetic immune checkpoint engagers protect HLA-deficient iPSCs and derivatives from innate immune cell cytotoxicity. Cell Stem Cell. 2023;30(11):1538-1548.e4. doi:10.1016/j.stem.2023.10.003

CAR 蛋白质检测工具 特性

G4S 单克隆抗体
  • 用具有两个或多个 G4S 重复序列的接头以及 (G3S)2 检出表面表达的 scFv 基 CAR（*检不出具有单个 G4S 序列的 scFv 基 CAR）
  • 可以检出种类广泛的 基于scFv 的 CAR，与 scFv 的抗原特异性无关
  • 在多参数流式检验抗体组合中表现良好

Whitlow/218 单克隆抗体
  • 检出表面表达的含 Whitlow/218 接头序列的 scFv 基 CAR
  • 可以检出种类广泛的 基于scFv 的 CAR，与 scFv 的抗原特异性无关
  • 在多参数流式检验抗体组合中表现良好

Protein L
  • 与 scFv 中发现的人和鼠 κ 轻链序列结合，但亲和力不同
  • 具有不同亲和力的 Kappa 轻链结合
  • 不结合 λ 轻链序列
  • 难以并入多参数流式检验组合

表位标签抗体（Myc、FLAG 和 HA）
  • 研究级 CAR 可能含有表位标签
  • 表位标签抗体通常表现出高特异性
  • CAR 上的表位标签可能干扰正确的折叠和表面表达
  • 需要从临床级 CAR 构建体中移除表位标签

CAR 表达的替代标记物（GFP、TagBFP、LNGGFR）
  • CAR 构建体经常共表达 CAR 表达的替代标记物
  • 替代标记物的共表达可能并不总是与 CAR 蛋白表达相关

抗独特型单克隆抗体
  • 高度灵敏和特异
  • 难以开发和验证且耗时
  • 需要针对每个独特 scFv 生成抗独特型单克隆抗体，无论这些抗体靶向相同抗原还是不同抗原。

重组 CAR 靶抗原
  • 可用于检测 CAR 表面表达并评估 scFv 是否能够与其靶抗原结合。
  • 需要针对靶向不同抗原的每种 CAR 生成重组靶抗原
  • 可能难以表达和纯化
  • 稳定性不一致
  • 当 CAR 已与其天然靶抗原结合时，不适合检测 CAR 表面表达

资源