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SignalStar™ 二抗试剂盒可在 SignalStar™ 多重免疫组织化学实验中手动使用

产品信息：

signalstar-8plex  

储存：所有试剂盒组分都储存于 -20ºC。

稳定性：在建议的温度保存时，该试剂盒中所有组分均稳定至少 12 个月。不得超过 5 次冻/融循环。

应用：SignalStar 试剂盒适用于进行荧光多重免疫组织化学分析。

载玻片数目：该试剂盒包含足够着染 10 张载玻片的材料。
SignalStar 符号

目录

1 介绍：SignalStar™ 染色方法

SignalStar™ 多重免疫组织化学 (mIHC) 是一种采用抗体、寡核苷酸 (oligos) 和荧光团探究细胞存在情况、位置、功能和生物标记物共表达模式的技术。SignalStar 技术使得在维持空间背景和组织结构的同时检测多个表型靶标与功能靶标成为可能。洞悉这些对了解细胞如何组织并相互作用以影响组织微环境及推动疾病进展和对治疗作出反应至关重要。

SignalStar 系统的力量存在于 SignalStar 抗体设计中。这些抗体已就用于福尔马林固定、石蜡包埋 (FFPE) 的组织中经过严格验证，并且随后使用位点特异性偶联和彻底纯化方法偶联至唯一寡核苷酸标签。使用高度特异的互补性寡核苷酸和荧光团网络，科学家可以放大 3-8 种靶标的信号，即使这些靶标处于低丰度亦如此。

SignalStar Multiplex IHC 工作流程图

图 1. 将您所选像素尺寸（最多 3-8 种唯一寡核苷酸偶联抗体）下的所有抗体按混合物添加于一个初级孵育步骤中。带荧光染料（信道：488、594、647 和 750）的互补性寡核苷酸通过构造与抗体接合的寡核苷酸-荧光团结构体，在第一轮成像中放大多达 4 种寡核苷酸偶联抗体的信号。如果像素尺寸大于 4，则柔和移除第一轮的寡核苷酸和荧光团，并且进行第二轮放大以可视化多达 4 种额外的寡核苷酸偶联抗体；互补性寡核苷酸系统和使用荧光团移除过程使得从同一底物放大第二轮抗体成为可能，同时无交叉反应性。然后将 2 幅图像用专有或开源软件以计算方式对齐并融合，以生成由多达 8 种靶标组成的图像。

2 溶液和试剂

2.1 包含的试剂盒组分

包含在 SignalStar™ 二抗试剂盒中的材料
多达 3 种 SignalStar 寡核苷酸偶联二抗（见下文）
多达 3 种 SignalStar 互补性寡核苷酸（见下文）
多达 3 种二级封闭同型对照抗体
SignalStar™ Antibody Diluent A
SignalStar™ Antibody Diluent B
包含在 SignalStar™ 多重 IHC 缓冲液试剂盒中的材料
多达 7 种 SignalStar 寡核苷酸偶联抗体（见下文）
多达 7 种 SignalStar 互补性寡核苷酸（见下文）
SignalStar™ Antibody Diluent A
SignalStar™ Antibody Diluent B
SignalStar™ Amplification Buffer A
SignalStar™ Amplification Buffer B
SignalStar™ Amplification Oligo Set A:
 488
 594
 647
 750
SignalStar™ Amplification Oligo Set B:
 488
 594
 647
 750
SignalStar™ Ligation Buffer
T4 DNA 连接酶 (5 U/µL)
ATP (100 mM)
10X dsDNase Buffer
dsDNase
 

包括 SignalStar 寡核苷酸偶联抗体 (A) 和 SignalStar 互补性寡核苷酸 (B)，它们在订购时选定并随各自寡核苷酸-抗体对 (C) 成套提供。请参见以下示例。

SignalStar 寡核苷酸抗体

2.2 不包括所要求的试剂

  • 重要事项：SignalStar 二抗检测所需的一抗
  • 重要事项：SignalStain® Antibody Diluent #8112 或其他推荐的一抗稀释剂
  • SignalStain® EDTA Unmasking Solution (10X) #14747
  • 二甲苯（用于脱蜡）
  • 乙醇，无水变性，组织学分级（100% 和 95%）
  • Decloaking Chamber (Biocare Medical, #DC2012)
  • Tris Buffered Saline with Tween 20 (TBST-10X) #9997
  • DAPI #4083
  • ProLong Gold Antifade Reagent #9071
  • Nuclease-free Water #12931
  • 10% 中性缓冲福尔马林
  • 低留置移液器吸头
  • 载玻片处理容器
  • 疏水屏障笔
  • 玻璃盖片
  • 带电荷载玻片
  • 对照组织

3 开始之前的重要考虑事项

警告

在设置实验之前，请完整阅读溶液制备和实验步骤。
警告

请勿合并相同荧光信道的互补性寡核苷酸。 对于每个荧光信道，成像轮次可以含有仅 1 种互补性性寡核苷酸。切勿在相同成像轮次合并专属于相同荧光信道的互补性寡核苷酸，因为这会使分析结果不可解读。
 
警告

切勿合并来自不同检验组合的抗体。 如果您同时运行多个检验组合，则必须为每个检验组合生成单独的抗体/互补性寡核苷酸混合物。
警告

SIGNALSTAR 试剂盒中的某些组分具有粘性。如果溶液未准确测量或未充分混合，荧光信号可能会变动不定或减弱。使用低留置移液器吸头将 SignalStar 试剂盒组分混合到 15 mL 锥形管中。缓慢移液以确保准确性。在室温下颠倒转动 20 分钟。 不使用时，所有 SignalStar 试剂盒组分均储存于冰上。一旦合并，SignalStar 溶液应保存在室温并迅速使用。
注意：

请确认您的 SignalStar 检验组合设计是否要求 2 轮成像。 利用本文档第 9.1 节和第 8.1 节中的 SignalStar 检验组合设计示例和 SignalStar 检验组合设计工作表，获取指导和帮助。
注意：

载玻片应在完成染色的 8 小时以内成像。 如果载玻片未在这个时间段以内成像，则荧光信号可能减弱。
注意：

确认您的显微镜可以检测此试剂盒中提供的荧光团。 成像时，除 DAPI 外，还存在 4 个需要采集的荧光信道。请联系您的仪器供应商以确认仪器设置。
 
荧光信道 激发光波长 (nm) 发射光波长 (nm) 激光线 通用滤光器
488 488 520 488 FITC
594 590 618 561/594 Texas Red
647 650 668 594/633 Cy®5
750 752 776 633 Cy®7
注

建议应通过将单张染色的载玻片对上述光谱成像，创建光谱库。 这可以实现更好的通道分离，以帮助最大限度降低光谱交叉干扰的可能性。
注

建议使用 DAPI 浓缩物，而不是含 DAPI 的封固剂。 DAPI 亮染便利更好地对齐图像。
注

如果对本实验步骤有任何偏离，则不保证结果。 SignalStar 实验步骤用指定的抗原修复步骤和染色步骤开发并优化。
注

建议使用阳性对照载玻片。 每次运行中应纳入一种组织，其中生色性染色已经对该组织确认多重检验组合中存在所有靶标。
注

组织制备和固定方法可能有所不同，因此提供足够的抗体试剂以供在 1:50 至 1:200 稀释范围内使用。 建议以 1:100 的比例使用每种抗体进行初步测试，以确定是否需要滴定。
注

在整个染色过程中，尽可能沥干孵育液和 dH2O，同时不允许载玻片干透。 在每个步骤之后，从每张载玻片彻底拂去液体，然后继续下一个步骤。
注

以下 SignalStar 试剂盒组分可在使用前于 4℃ 下解冻过夜：

  • SignalStar™ Antibody Diluent A
  • SignalStar™ Antibody Diluent B
  • SignalStar™ Amplification Buffer A
  • SignalStar™ Amplification Buffer B
  • SignalStar™ Ligation Buffer

 

4 SignalStar 第 1 轮成像：溶液配制

警告

每种溶液都应新鲜制作并及时使用。请阅读 SignalStar 第 1 轮成像：在制作溶液之前，请完整阅读第 5 部分的使用实验步骤。

注意：

除非另有说明，SignalStar 试剂盒组分应在使用前立即于室温下解冻，然后在使用时存放在冰上。

4.1 一抗溶液

注意：

该试剂盒不包含一抗稀释剂和一抗。 请按照制造商提供的推荐稀释剂中的推荐稀释度使用一抗。确认最终体积与下表所列相符。
注意：

购买一抗时，请确保您的一抗已经过验证，可用于福尔马林固定、石蜡包埋的组织。 您可以在 www.cellsignal.com 上查看经过 IHC-P 验证的抗体的综合目录。
警告

如果使用多种一抗和二抗： 结合来自独特来源物种的所有一抗（例如，兔单克隆抗体、小鼠单克隆抗体和大鼠单克隆抗体）。请勿混合来自同一来源物种的一抗。
 

试剂盒组分/试剂		 所需体积
5 张载玻片 (µL) 10 张载玻片 (µL)
一抗稀释液（例如，SignalStain® Antibody Diluent #8112）    
每种一抗（例如，FoxP3 (D2W8ETM) Rabbit mAb #98377）    
总体积 750 1,500

4.2 SignalStar 二抗溶液

警告

SIGNALSTAR 抗体稀释液粘稠。如果溶液未准确测量或未充分混合，荧光信号可能会变动不定或减弱。使用低留置移液器吸头将 SignalStar 试剂盒组分混合到 15 mL 锥形管中。缓慢移液以确保准确性。在室温下颠倒转动 20 分钟。 不使用时，所有 SignalStar 试剂盒组分均储存于冰上。一旦合并，SignalStar 溶液应保存在室温并迅速使用。
注意：

如果使用多种一抗和二抗：结合所有二抗和互补寡核苷酸，用于检测独特来源物种（例如，抗兔、抗小鼠和抗大鼠）。
 

试剂盒组分/试剂		 所需体积
5 张载玻片 (µL) 10 张载玻片 (µL)
SignalStar Antibody Diluent A 525 1,050
SignalStar Antibody Diluent B 225 450
每种二抗 - SignalStar 偶联物 7.5 15
每种二抗 - 互补寡核苷酸 7.5 15
总体积 高达 795 高达 1,590

4.3 SignalStar 二级封闭液

警告

SIGNALSTAR 抗体稀释液粘稠。如果溶液未准确测量或未充分混合，荧光信号可能会变动不定或减弱。使用低留置移液器吸头将 SignalStar 试剂盒组分混合到 15 mL 锥形管中。缓慢移液以确保准确性。在室温下颠倒转动 20 分钟。 不使用时，所有 SignalStar 试剂盒组分均储存于冰上。一旦合并，SignalStar 溶液应保存在室温并迅速使用。
注意：

如果使用多种一抗和二抗：将所有二抗阻断同型对照抗体与所包含的独特来源物种（例如兔单克隆抗体、小鼠单克隆抗体和大鼠单克隆抗体）结合起来。
 

试剂盒组分/试剂		 所需体积
5 张载玻片 (µL) 10 张载玻片 (µL)
SignalStar Antibody Diluent A 525 1,050
SignalStar Antibody Diluent B 225 450
每种二级封闭同型对照 7.5 15
总体积 高达 772.5 高达 1,545

4.4 第 1 轮成像溶液

注意：

一旦配制，SignalStar Imaging Round 1 Solution 应含有（随试剂盒订购的多达 7 种）所有抗体（包括用于第 1 轮成像和第 2 轮成像的那些抗体）和用于第 1 轮成像的互补性寡核苷酸。利用本文档第 9.1 节和第 8.1 节中的 SignalStar 检验组合设计示例和 SignalStar 检验组合设计工作表，获取指导和帮助。
警告

请勿合并相同荧光信道的互补性寡核苷酸。 请勿将第 1 轮成像和第 2 轮成像中的互补性寡核苷酸合并。
警告

SIGNALSTAR 抗体稀释液粘稠。如果溶液未准确测量或未充分混合，荧光信号可能会变动不定或减弱。使用低留置移液器吸头将 SignalStar 试剂盒组分混合到 15 mL 锥形管中。缓慢移液以确保准确性。在室温下颠倒转动 20 分钟。 不使用时，所有 SignalStar 试剂盒组分均储存于冰上。一旦合并，SignalStar 溶液应保存在室温并迅速使用。
 

试剂盒组分		 所需体积
5 张载玻片 (µL) 10 张载玻片 (µL)
SignalStar Antibody Diluent A 525 1,050
SignalStar Antibody Diluent B 225 450
每个 SignalStar 寡核苷酸偶联抗体 7.5 15
每次第 1 轮成像：SignalStar 互补性寡核苷酸 7.5 15
总体积 高达 825 高达 1,650

4.5 第 1 轮成像：放大液 1

警告

SIGNALSTAR 放大液粘稠。如果溶液未准确测量或未充分混合，荧光信号可能会变动不定或减弱。使用低留置移液器吸头将 SignalStar 试剂盒组分混合到 15 mL 锥形管中。缓慢移液以确保准确性。在室温下颠倒转动 20 分钟。 不使用时，所有 SignalStar 试剂盒组分均储存于冰上。一旦合并，SignalStar 溶液应保存在室温并迅速使用。
 

试剂盒组分		 所需体积
5 张载玻片 (µL) 10 张载玻片 (µL)
SignalStar Amplification Buffer A 3,000 6,000
SignalStar Amplification Buffer B 3,000 6,000
SignalStar Amplification Oligo A-488 60 120
SignalStar Amplification Oligo A-594 60 120
SignalStar Amplification Oligo A-647 60 120
SignalStar Amplification Oligo A-750 60 120
总体积 6,240 12,480

4.6 第 1 轮成像：放大液 2

警告

SIGNALSTAR 放大液粘稠。如果溶液未准确测量或未充分混合，荧光信号可能会变动不定或减弱。使用低留置移液器吸头将 SignalStar 试剂盒组分混合到 15 mL 锥形管中。缓慢移液以确保准确性。在室温下颠倒转动 20 分钟。 不使用时，所有 SignalStar 试剂盒组分均储存于冰上。一旦合并，SignalStar 溶液应保存在室温并迅速使用。
 

试剂盒组分		 所需体积
5 张载玻片 (µL) 10 张载玻片 (µL)
SignalStar Amplification Buffer A 3,000 6,000
SignalStar Amplification Buffer B 3,000 6,000
SignalStar Amplification Oligo B-488 60 120
SignalStar Amplification Oligo B-594 60 120
SignalStar Amplification Oligo B-647 60 120
SignalStar Amplification Oligo B-750 60 120
总体积 6,240 12,480

4.7 第 1 轮成像：连接溶液

注意：

配制溶液时，所有 SignalStar 试剂盒组分均储存于冰上。一旦合并，SignalStar 溶液应保存在室温并迅速使用。
 

试剂盒组分/试剂		 所需体积
5 张载玻片 (µL) 10 张载玻片 (µL)
SignalStar 连接缓冲液 375 750
Nuclease-free Water #12931 352.5 705
T4 DNA 连接酶 (5 U/µL) 15 30
ATP (100 mM) 7.5 15
总体积 750 1,500

4.8 不包括额外的所需溶液

  • 1X EDTA 修复液：要配制 250 ml 1X EDTA Unmasking Solution，将 25 ml SignalStain® EDTA Unmasking Solution (10X) #14747 用 225 ml dH2O 稀释。
  • 10% 中性缓冲福尔马林
  • 1X Tris Buffered Saline with Tween 20 (TBST)：要配制 1 L 1X TBST，将 10 ml Tris Buffered Saline with Tween 20 (TBST-10X) #9997 加入 900 ml dH2O ，混合。

5 SignalStar 第 1 轮成像：使用的实验步骤

警告

每种溶液都应新鲜制作并及时使用。请阅读 SignalStar 第 1 轮成像：在制作溶液之前，请完整阅读第 5 部分的使用实验步骤。

5.1 载玻片焙烘

注

可以在您开始实验前当天焙烘载玻片。 此步骤可使固体石蜡融化并使组织更好地粘附在载玻片上。
 

1. 将载玻片在 60°C 孵育至少 30 分钟。

5.2 脱蜡/水化

注意：

一旦载玻片脱蜡，任何时候切勿让它们干透。加湿箱用于所有孵育步骤。确保每种溶液覆盖整个组织。
 

2. 在二甲苯洗液中孵育切片 3 次，每次 5 分钟。
 

3. 在 100% 乙醇洗液中孵育切片 2 次，每次 10 分钟。
 

4. 在 95% 乙醇洗液中孵育切片 2 次，每次 10 分钟。
 

5. 用 dH2O 中洗涤切片 2 次，每次 5 分钟。

5.3 抗原修复

注

建议在加压蒸煮器中进行 EDTA 抗原修复，以最大限度修复表位。本实验步骤描述了对 Biocare Medical Decloaking Chamber #DC2012 建议的条件。设备特定的设置。对于其他高压锅，应使用制造商推荐的操作说明。
 
6. 
 		 将载玻片放入 250 ml 室温 1X EDTA Unmasking Solution 中的 24 位载玻片架上。添加空白载玻片以彻底填充载玻片架。
 

7. 将 500 ml dH2O 置入加压蒸煮器中。
 

8. 将切片夹放入加压蒸煮器，直至接触到隔热板。用载玻片容器盖子盖住一部分。
注

可能有利的是，将第二个以 250 mL 水和空白载玻片填充的 24 位载玻片架置入加压蒸煮器并用盖子盖住一部分。
 

9. 密封蒸煮器室，并继续进行修复。将 Biocare Medical Decloaking Chamber #DC2012 设置为 110°C，持续 30 分钟。
 

10. 小心使设备通气，随后取下盖子。
 

11. 从去掩蔽室取出载玻片容器，允许在实验台上冷却 10 分钟。
 
12. 
 		 将载玻片容器置于 dH2O 水龙头下，并向载玻片容器直接添加水直至所有 EDTA 均由 dH2O 替换为止。

5.4 一抗和二抗染色

 

13. 彻底甩掉载玻片上的液体，并根据制造商的方案在 150 µL 一抗溶液中孵育。
注

可以将载玻片在 4°C 的一抗溶液中孵育过夜，以将实验步骤分为多天。

 

14. 从载玻片彻底拂去液体，然后浸没于 1X TBST 中 30 秒。
 

15. 彻底甩干载玻片上的液体，并于室温下在 150 µL 二抗溶液中孵育 40 分钟。
 

16. 从载玻片彻底拂去液体，然后浸没于 1X TBST 中 30 秒。
 

17. 彻底甩干载玻片上的液体，并于室温下在 150 µL 二抗溶液中孵育 40 分钟。
 

18. 从载玻片彻底拂去液体，然后浸没于 1X TBST 中 30 秒。
 

19. 将载玻片在 10% 中性缓冲福尔马林中室温孵育 5 分钟。
 

20. 从载玻片彻底拂去液体，然后浸没于 dH2O 中 30 秒。

5.5 第 1 轮成像：染色

 

21. 将载玻片在 150 μL SignalStar Imaging Round 1 Solution 中室温孵育 40 分钟。
注

可以将载玻片在 4°C 下孵育过夜，以便将实验步骤拆分成多天。

 

22. 从载玻片彻底拂去液体，然后浸没于 1X TBST 中 30 秒。
 

23. 将载玻片在 10% 中性缓冲福尔马林中室温孵育 5 分钟。
 

24. 从载玻片彻底拂去液体，然后浸没于 dH2O 中 30 秒。

5.6 第 1 轮成像：扩增

 
25. 
 		 用 Amplification Solution 1 和 2 进行 8 轮放大。使用第 8.2 节中的 SignalStar 第 1 轮成像清单跟踪进度。每个放大轮次由以下步骤组成：
  1. 将载玻片在 150 μL Amplification Solution 1 中孵育 8 分钟。
  2. 从载玻片彻底拂去液体，然后浸没于 dH2O 中 30 秒。
  3. 将载玻片在 150 μL Amplification Solution 2 中孵育 8 分钟。
  4. 从载玻片彻底拂去液体，然后浸没于 dH2O 中 30 秒。

5.7 第 1 轮成像：连接

 

26. 将载玻片在 150 μL SignalStar Ligation Buffer 中室温孵育 20 分钟。
 

27. 从载玻片彻底拂去液体，然后浸没于 dH2O 中 30 秒。

5.8 第 1 轮成像：图像

 

28. 根据数据表说明，配制 DAPI #4083 溶液。
 

29. 将载玻片浸没于 1X TBST 中 30 秒。
 

30. 用 DAPI 溶液复染。
 

31. 将载玻片浸没于 1X TBST 中 30 秒。
 

32. 将载玻片用 ProLong Gold Antifade Reagent #9071 封装。
 

33. 尽快对载玻片成像。信号应保持稳健长达 8 小时。
注

一旦成像完成，就可以从载玻片移除荧光信号，从而可以进行另一轮成像。在第一轮成像之后尽快进行第 2 轮成像。

6 SignalStar 第 2 轮成像：溶液配制

警告

每种溶液都应新鲜制作并及时使用。请阅读 SignalStar 第 2 轮成像：在制作溶液之前，请完整阅读第 7 部分的使用实验步骤。

注意：

SIGNALSTAR 第 2 轮成像仅为要求两个成像轮次的抗体检验组合所需。利用本文档第 9.1 节和第 8.1 节中的 SignalStar 检验组合设计示例和 SignalStar 检验组合设计工作表，获取指导和帮助。
注意：

除非另有说明，SignalStar 试剂盒组分应在使用前立即于室温下解冻，然后在使用时存放在冰上。

6.1 荧光移除液

注意：

配制溶液时，所有 SignalStar 试剂盒组分均储存于冰上。一旦合并，SignalStar 溶液应保存在室温并迅速使用。
 

试剂盒组分/试剂		 所需体积
5 张载玻片 (µL) 10 张载玻片 (µL)
10X dsDNase Buffer 75 150
dsDNase 7.5 15
Nuclease-free Water #12931 667.5 1,335
总体积 750 1,500

6.2 第 2 轮成像溶液

注意：

一旦配制，SignalStar SignalStar Imaging Round 2 Solution 应仅含有用于第 2{2} 轮成像的互补性寡核苷酸。利用本文档第 9.1 节和第 8.1 节中的 SignalStar 检验组合设计示例和 SignalStar 检验组合设计工作表，获取指导和帮助。
警告

不向第 2 轮成像溶液添加 SIGNALSTAR 偶联物。
警告

请勿合并相同荧光信道的互补性寡核苷酸。 请勿将第 1 轮成像和第 2 轮成像中的互补性寡核苷酸合并。
警告

SIGNALSTAR 抗体稀释液粘稠。如果溶液未准确测量或未充分混合，荧光信号可能会变动不定或减弱。使用低留置移液器吸头将 SignalStar 试剂盒组分混合到 15 mL 锥形管中。缓慢移液以确保准确性。在室温下颠倒转动 20 分钟。 不使用时，所有 SignalStar 试剂盒组分均储存于冰上。一旦合并，SignalStar 溶液应保存在室温并迅速使用。
 

试剂盒组分		 所需体积
5 张载玻片 (µL) 10 张载玻片 (µL)
SignalStar Antibody Diluent A 525 1,050
SignalStar Antibody Diluent B 225 450
每次第 2 轮成像：SignalStar 互补性寡核苷酸 7.5 15
总体积 高达 780 高达 1,560

6.3 第 2 轮成像：放大液 1

警告

SIGNALSTAR 抗体稀释液粘稠。如果溶液未准确测量或未充分混合，荧光信号可能会变动不定或减弱。使用低留置移液器吸头将 SignalStar 试剂盒组分混合到 15 mL 锥形管中。缓慢移液以确保准确性。在室温下颠倒转动 20 分钟。 不使用时，所有 SignalStar 试剂盒组分均储存于冰上。一旦合并，SignalStar 溶液应保存在室温并迅速使用。
 

试剂盒组分		 所需体积
5 张载玻片 (µL) 10 张载玻片 (µL)
SignalStar Amplification Buffer A 3,000 6,000
SignalStar Amplification Buffer B 3,000 6,000
SignalStar Amplification Oligo A-488 60 120
SignalStar Amplification Oligo A-594 60 120
SignalStar Amplification Oligo A-647 60 120
SignalStar Amplification Oligo A-750 60 120
总体积 6,240 12,480

6.4 第 2 轮成像：放大液 2

警告

SIGNALSTAR 抗体稀释液粘稠。如果溶液未准确测量或未充分混合，荧光信号可能会变动不定或减弱。使用低留置移液器吸头将 SignalStar 试剂盒组分混合到 15 mL 锥形管中。缓慢移液以确保准确性。在室温下颠倒转动 20 分钟。 不使用时，所有 SignalStar 试剂盒组分均储存于冰上。一旦合并，SignalStar 溶液应保存在室温并迅速使用。
 

试剂盒组分		 所需体积
5 张载玻片 (µL) 10 张载玻片 (µL)
SignalStar Amplification Buffer A 3,000 6,000
SignalStar Amplification Buffer B 3,000 6,000
SignalStar Amplification Oligo B-488 60 120
SignalStar Amplification Oligo B-594 60 120
SignalStar Amplification Oligo B-647 60 120
SignalStar Amplification Oligo B-750 60 120
总体积 6,240 12,480

6.5 第 2 轮成像：SignalStar Ligation Solution

注意：

配制溶液时，所有 SignalStar 试剂盒组分均储存于冰上。一旦合并，SignalStar 溶液应保存在室温并迅速使用。
 

试剂盒组分/试剂		 所需体积
5 张载玻片 (µL) 10 张载玻片 (µL)
SignalStar 连接缓冲液 375 750
Nuclease-free Water #12931 352.5 705
T4 DNA 连接酶 (5 U/µL) 15 30
ATP (100 mM) 7.5 15
总体积 750 1,500

7 SignalStar 第 2 轮成像：使用的实验步骤

警告

每种溶液都应新鲜制作并及时使用。请阅读 SignalStar 第 2 轮成像：在制作溶液之前，请完整阅读第 7 部分的使用实验步骤。

注意：

SIGNALSTAR 第 2 轮成像仅为要求两个成像轮次的抗体检验组合所需。利用本文档第 9.1 节和第 8.1 节中的 SignalStar 检验组合设计示例和 SignalStar 检验组合设计工作表，获取指导和帮助。

7.1 移除荧光信号

 

1. 采集图像用于第 1 轮成像后，将载玻片浸泡于 dH2O 中 ≥30 分钟，以轻柔取下盖玻片而不损坏组织。
 

2. 将载玻片在 37°C 下于 150 μL 荧光移除液中孵育 2 小时。
 

3. 将载玻片浸没于 dH2O 中 30 秒。
 

4. 可选：

  1. 用 ProLong Gold Antifade Reagent #9071 with DAPI #4083 封装载玻片，并对载玻片成像以确认无荧光信号余留。
  2. 将载玻片浸泡于 dH2O 中 ≥30 分钟，以轻柔取下盖玻片而不损坏组织。
  3. 将载玻片浸没于 dH2O 中 30 秒。

7.2 第 2 轮成像：染色

 

5. 将载玻片在室温于 150 μL SignalStar 第 2 轮成像液中孵育 40 分钟。
 

6. 从载玻片彻底拂去液体，然后浸没于 dH2O 中 30 秒。

7.3 第 2 轮成像：扩增

 
7. 
 		 用 Amplification Solution 1 和 2 进行 8 轮放大。使用第 8.3 节中的 SignalStar 第 2 轮成像清单跟踪进度。 每个放大轮次由以下步骤组成：
  1. 将载玻片在 150 μL Amplification Solution 1 中孵育 8 分钟。
  2. 从载玻片彻底拂去液体，然后浸没于 dH2O 中 30 秒。
  3. 将载玻片在 150 μL Amplification Solution 2 中孵育 8 分钟。
  4. 从载玻片彻底拂去液体，然后浸没于 dH2O 中 30 秒。

7.4 第 2 轮成像：连接

 

8. 将载玻片在 150 μL SignalStar Ligation Buffer 中室温孵育 20 分钟。
 

9. 从载玻片彻底拂去液体，然后浸没于 dH2O 中 30 秒。

7.5 第 2 轮成像：图像

 

10. 根据数据表说明，配制 DAPI #4083 溶液。
 

11. 将载玻片浸没于 1X TBST 中 30 秒。
 

12. 用 DAPI 溶液复染。
 

13. 将载玻片浸没于 1X TBST 中 30 秒。
 

14. 从载玻片彻底拂去液体，然后浸没于 dH2O 中 30 秒。
 

15. 将载玻片用 ProLong Gold Antifade Reagent #9071 封装。
 

16. 尽快对载玻片成像。信号应保持稳健长达 8 小时。

8 用户工作表

8.1 SignalStar 检验组合设计工作表

寡核苷酸偶联抗体 互补性寡核苷酸 产品对编号 。 488 594 647 750
               
               
               
               
               
               
               
               

（参见附录 9.1，了解检验组合设计示例）

8.2 SignalStar 第 1 轮成像清单

放大轮次 步骤编号 ✓ 步骤
第 1 轮放大 1 ☐ 在放大液 1 中孵育 8 分钟。
2 ☐ 将载玻片浸没于 dH2O 中 30 秒。
3 ☐ 在放大液 2 中孵育 8 分钟。
4 ☐ 将载玻片浸没于 dH2O 中 30 秒。
第 2 轮放大 5 ☐ 在放大液 1 中孵育 8 分钟。
6 ☐ 将载玻片浸没于 dH2O 中 30 秒。
7 ☐ 在放大液 2 中孵育 8 分钟。
8 ☐ 将载玻片浸没于 dH2O 中 30 秒。
第 3 轮放大 9 ☐ 在放大液 1 中孵育 8 分钟。
10 ☐ 将载玻片浸没于 dH2O 中 30 秒。
11 ☐ 在放大液 2 中孵育 8 分钟。
12 ☐ 将载玻片浸没于 dH2O 中 30 秒。
第 4 轮放大 13 ☐ 在放大液 1 中孵育 8 分钟。
14 ☐ 将载玻片浸没于 dH2O 中 30 秒。
15 ☐ 在放大液 2 中孵育 8 分钟。
16 ☐ 将载玻片浸没于 dH2O 中 30 秒。
第 5 轮放大 17 ☐ 在放大液 1 中孵育 8 分钟。
18 ☐ 将载玻片浸没于 dH2O 中 30 秒。
19 ☐ 在放大液 2 中孵育 8 分钟。
20 ☐ 将载玻片浸没于 dH2O 中 30 秒。
第 6 轮放大 21 ☐ 在放大液 1 中孵育 8 分钟。
22 ☐ 将载玻片浸没于 dH2O 中 30 秒。
23 ☐ 在放大液 2 中孵育 8 分钟。
24 ☐ 将载玻片浸没于 dH2O 中 30 秒。
第 7 轮放大 25 ☐ 在放大液 1 中孵育 8 分钟。
26 ☐ 将载玻片浸没于 dH2O 中 30 秒。
27 ☐ 在放大液 2 中孵育 8 分钟。
28 ☐ 将载玻片浸没于 dH2O 中 30 秒。
第 8 轮放大 29 ☐ 在放大液 1 中孵育 8 分钟。
30 ☐ 将载玻片浸没于 dH2O 中 30 秒。
31 ☐ 在放大液 2 中孵育 8 分钟。
32 ☐ 将载玻片浸没于 dH2O 中 30 秒。

8.3 SignalStar 第 2 轮成像清单

放大轮次 步骤编号 ✓ 步骤
第 1 轮放大 1 ☐ 在放大液 1 中孵育 8 分钟。
2 ☐ 将载玻片浸没于 dH2O 中 30 秒。
3 ☐ 在放大液 2 中孵育 8 分钟。
4 ☐ 将载玻片浸没于 dH2O 中 30 秒。
第 2 轮放大 5 ☐ 在放大液 1 中孵育 8 分钟。
6 ☐ 将载玻片浸没于 dH2O 中 30 秒。
7 ☐ 在放大液 2 中孵育 8 分钟。
8 ☐ 将载玻片浸没于 dH2O 中 30 秒。
第 3 轮放大 9 ☐ 在放大液 1 中孵育 8 分钟。
10 ☐ 将载玻片浸没于 dH2O 中 30 秒。
11 ☐ 在放大液 2 中孵育 8 分钟。
12 ☐ 将载玻片浸没于 dH2O 中 30 秒。
第 4 轮放大 13 ☐ 在放大液 1 中孵育 8 分钟。
14 ☐ 将载玻片浸没于 dH2O 中 30 秒。
15 ☐ 在放大液 2 中孵育 8 分钟。
16 ☐ 将载玻片浸没于 dH2O 中 30 秒。
第 5 轮放大 17 ☐ 在放大液 1 中孵育 8 分钟。
18 ☐ 将载玻片浸没于 dH2O 中 30 秒。
19 ☐ 在放大液 2 中孵育 8 分钟。
20 ☐ 将载玻片浸没于 dH2O 中 30 秒。
第 6 轮放大 21 ☐ 在放大液 1 中孵育 8 分钟。
22 ☐ 将载玻片浸没于 dH2O 中 30 秒。
23 ☐ 在放大液 2 中孵育 8 分钟。
24 ☐ 将载玻片浸没于 dH2O 中 30 秒。
第 7 轮放大 25 ☐ 在放大液 1 中孵育 8 分钟。
26 ☐ 将载玻片浸没于 dH2O 中 30 秒。
27 ☐ 在放大液 2 中孵育 8 分钟。
28 ☐ 将载玻片浸没于 dH2O 中 30 秒。
第 8 轮放大 29 ☐ 在放大液 1 中孵育 8 分钟。
30 ☐ 将载玻片浸没于 dH2O 中 30 秒。
31 ☐ 在放大液 2 中孵育 8 分钟。
32 ☐ 将载玻片浸没于 dH2O 中 30 秒。

9 附录

9.1 SignalStar 检验组合设计示例

寡核苷酸偶联抗体 互补性寡核苷酸 产品对编号 。 488 594 647 750
Goat Anti-Rabbit IgG (H&L) Antibody 互补性寡核苷酸
(CO-0055-488)		 30599 1 ●      
PD-L1 (E1L3N®) XP® Rabbit mAb
(SignalStar™ Conjugate 0005)		 互补性寡核苷酸
(CO-0005-594)		 28249 1   ●    
TIM-3 (D5D5R™) XP® Rabbit mAb
(SignalStar™ Conjugate 0010)		 互补性寡核苷酸
(CO-0010-647)		 15231 1     ●  
Ki-67 (8D5) Mouse mAb
(SignalStar™ Conjugate 0014)		 互补性寡核苷酸
(CO-0014-750)		 56398 1       ●
CD8ɑ (D8A8Y) Rabbit mAb
(SignalStar™ Conjugate 0004)		 互补性寡核苷酸
(CO-0004-488)		 45747 2 ●      
CD68 (D4B9C) XP® Rabbit mAb
(SignalStar™ Conjugate 0007)		 互补性寡核苷酸
(CO-0007-594)		 77318 2   ●    
CD20 (E7B7T) XP® Rabbit mAb
(SignalStar™ Conjugate 0011)		 互补性寡核苷酸
(CO-0011-647)		 36775 2     ●  
Pan-Keratin (C11) Mouse mAb
(SignalStar™ Conjugate 0003)		 互补性寡核苷酸
(CO-0003-750)		 97227 2       ●

9.2 故障排除和常见问题

如何验证 SignalStar Multiplex IHC 试剂盒和试剂？

CST 彻底验证了 SignalStar Multiplex IHC Panel Builder 菜单中可提供的每种抗体。通过滴定和荧光团配对以及在两轮成像中测试抗体的各种组合。对各种肿瘤和组织类型进行测试。我们还严格测试了传统显色测定法中使用的亲本抗体，因这些抗体充当这种荧光测定法的基础。我们无法测试所有多重配置或组织。如有任何疑问，请联系客户支持。

我是否需要针对自己正在使用的组织类型优化 SignalStar Multiplex IHC 试剂盒和试剂？

SignalStar Multiplex IHC 试剂盒和试剂已针对抗体的荧光团配对和顺序作了优化。由于组织在靶标的质量和表达水平方面不同，将您的检验组合中抗体的浓度升高 2 倍或降低 0.5 倍可能有助在您的实验中实现最佳信号。为了达到更低的背景水平和更高的 S/N 水平，可能需要进行此类小滴定。

对 SignalStar Multiplex IHC 进行成像需要哪些成像仪器规格？

除 DAPI 之外，还存在四个需要采集的荧光信道。请联系您的仪器供应商以确认仪器规格。确保使用 Texas Red 滤光片组来可视化 594 信道。TRITC 滤波器并不理想，从而可能会导致信号输出减弱。

荧光信道 激发光波长 (nm) 发射光波长 (nm) 激光线 通用滤光器
488 488 520 488 FITC
594 590 618 561/594 Texas Red
647 650 668 594/633 Cy®5
750 752 776 633 Cy®7

SignalStar mIHC 是一种基于信号放大的技术，因此对于初始成像，我们建议自动曝光控制组织以确定每个信道的最佳曝光时间。

对于某些仪器，光谱渗漏可能发生在 594 和 647 信道之间。减少 647 信道中的抗体浓度可能有助于解决渗漏问题。在检测板设计期间也可以考虑光谱渗漏，从而将强表型标记物与弱表达靶标进行光谱分离。

该测定法是否对冷冻组织有效？

尚未验证 SignalStar Multiplex IHC 试剂盒与试剂用于冷冻组织。

你们是否有小鼠反应性抗体可提供？

是的，请在 SignalStar Multiplex IHC Panel Builder 的第一步中选择“小鼠”，以查看我们的小鼠反应性菜单。

我在你们的可提供抗体菜单中没看到我的目的靶标。我还能以某种方式在我的检测板中使用它吗？

尚未验证 SignalStar Multiplex IHC 试剂盒和试剂可配合我公司菜单以外的抗体使用。我们正在开发诸多定制解决方案以便在 SignalStar Multiplex IHC 测定法中使用您的自有抗体。

SignalStar mIHC 是一种无损技术。因此，为了使用目的抗体，您可以在 SignalStar 检测后对同一组织进行直接免疫荧光分析。SignalStar™ Fluorescence Removal Kit #32722 可让您在 SignalStar mIHC 后去除荧光寡核苷酸，以便对直接免疫荧光进行染色和可视化。

我能否将此检测中使用的抗体与直接偶联物组合？

尚未验证 SignalStar Multiplex IHC 试剂盒和试剂可与直接偶联物联合使用。SignalStar™ Fluorescence Removal Kit #32722 可让您在 SignalStar mIHC 后去除荧光寡核苷酸，以便对直接免疫荧光进行染色和可视化。我们发现，许多针对强细胞表面标记物的直接偶联物以这种方式使用时效果很好。请参阅我们去年春天在 AACR 上展示的最新海报，以了解更多信息。此外，请参阅我们用于直接免疫荧光成像的直接偶联抗体系列。

将我的 SignalStar 染色与系列切片上的生色性染色比较时，我看到更多阳性细胞。我如何知道这种过度染色是否正确？

在优化期间，我们发现荧光染色可能显示比显色性染色更高的阳性百分比。为确保任何过度染色为特异性，请确认用其他染色剂证明亚细胞定位和共定位正确。例如，如果所有 CD8＋ 细胞都为 CD3＋，则任何与显色性染色相比的 CD8＋过度染色很可能是正确的。

完成染色后我可能等多久才对切片成像？

对于第 1 轮成像，在完成染色后 8 小时内成像时，染色应显示稳定信号。对于第 2 轮成像，成像应尽可能接近于染色完成时进行，但是应当保持稳定长达 8 小时。

我是否需要针对自己正在使用的组织类型优化 SignalStar Multiplex IHC 试剂盒和试剂？

SignalStar Multiplex IHC 试剂盒和试剂已针对抗体的荧光团配对和顺序作了优化。由于组织在靶标的质量和表达水平方面不同，将您的检验组合中抗体的浓度升高 2 倍或降低 0.5 倍可能有助在您的实验中实现最佳信号。

该测定法中应包括哪种适当的阳性对照？是否需要多个对照？

通过显色性 IHC 证明每个靶标呈阳性的任何组织都可以充当阳性对照组织。因此，每个靶标都将要求阳性对照，这有时可能导致多个对照必不可少。为了最佳比较，各切片应尽可能连续。

我是否可以使用除实验步骤中提供的方法以外的其他抗原修复方法？

为了获得最佳效果，我们不建议偏离 SignalStar 实验步骤。但如果您无法使用实验步骤中详述的抗原修复方法，您可以尝试使用微波炉，不过它已被证明会导致荧光信号减弱。我们不建议在检测低丰度靶标时使用微波炉，并且我们无法保证结果。

使用微波进行抗原修复：

配制 1X EDTA Unmasking Solution：要配制 250 mL 1X EDTA Unmasking Solution，将 25 ml SignalStain® EDTA Unmasking Solution (10X) (#14747) 用 225 mL dH2O 稀释。将载玻片浸入 1X EDTA Unmasking Solution 中，放入微波炉中加热直至沸腾（功率级别 10 下约 2.5 分钟）。随后在亚沸温度 (95°-98°C) 下煮沸 15 分钟。在大多数常见微波炉中，这相当于在功率等级 3 下加热 8 分钟，然后在功率等级 2 下加热 7 分钟。然后从微波炉中取出，将载玻片容器置于 dH2O 水龙头下，并将水直接添加到载玻片容器中，直至由 dH2O 替换所有 EDTA 为止。无需冷却。

我希望在具有高水平自发荧光的脂肪组织/大脑/正常肾脏组织上进行这项检测。你们是否可以提供任何示例数据以证明该检测方法适用于这种组织类型？

虽然我们在优化过程中使用了各种肿瘤和组织类型，但我们无法考虑所有组织和表达水平。假设遵循了我们推荐的实验步骤，该检测应适用于厚度为 4-5 µM 的 FFPE 组织。此外，由于该检测方法具有高水平的扩增，即使非常高的自发荧光水平也可通过产生强烈的特异性信号来克服。

我可以使用其他封固剂代替 ProLong Gold Antifade Reagent #9071 吗？

Prolong Antifade 封固剂是此实验步骤的最佳选择。内部测试表明，SlowFade 抗褪色试剂会对信号强度产生负面影响。

Cell Signaling Technology、XP 和 SignalStar 均是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。
E1L3N 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的注册商标。Cy 和 CyDye 是 GE Healthcare 的注册商标。第 10,781,477 号美国专利，外国对应物，以及由此而来的儿童专利。所有其他商标均属各自所有者专有。访问我们的商标信息页面。
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