免疫荧光法（免疫细胞化学）

IMPORTANT: This protocol employs an atypical fixation and denaturation strategy with which only certain targets are compatible. 在适当的情况下，该实验步骤将在特定于产品的网页上的“产品信息”横幅下链接至其经过验证的抗体。

A. 溶液与试剂

注： 用反渗透去离子 (RODI) 水或等效净化水制备溶液。

1. 1X Phosphate Buffered Saline (PBS): To prepare 1L 1X PBS, add 100 ml 10X Wash Buffer, Phosphate Buffered Saline (#12528) to 900 ml dH₂O, mix. 调节 pH 至 8.0。
2. 乙醇，70% 溶液，去离子化。
3. 1.5 M 盐酸。
4. Blocking Buffer: Purchase ready-to-use Immunofluorescence Blocking Buffer (#12411), or prepare a 1X PBS / 5% normal serum / 0.3% Triton^™ X-100 buffer by adding 0.5 ml normal serum from the same species as the secondary antibody (e.g., Normal Goat Serum (#5425)) and 30 µl Triton^™ X-100 to 9.5 mL 1X PBS. 4°C 保存。
5. Antibody Dilution Buffer: Purchase ready-to-use Immunofluorescence Antibody Dilution Buffer (#12378), or prepare a 1X PBS / 1% BSA / 0.3% Triton^™ X-100 buffer by adding 0.1 g BSA (#9998) and 30 µl Triton^™ X-100 to 10 mL 1X PBS. 4°C 保存。
6. Fluorochrome-conjugated Secondary Antibody : 使用对您的一抗宿主物种（例如兔子）具有反应性的二抗。单击此处获得批准用于免疫荧光法的二抗列表。

B. 固定与透化

注： 所有后续孵育都应在室温（20-25°C）下进行， 除非另有说明。

1. 抽吸介质，然后用冰冷的 70％ 乙醇覆盖标本（使用量足以完全覆盖 3-5 mm 的深度，请勿干燥）。
2. 可固定 5 分钟。
3. 用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
4. 吸出 PBS，然后将固定的标本在 1.5 M HCl 中孵育 1 小时。
5. 用 1X PBS 漂洗两次，每次 5 分钟。

C. 免疫染色

1. 在封闭缓冲液中封闭标本 60 分钟。
2. 封闭时，在抗体稀释缓冲液中制备一抗（建议的稀释范围请参见产品网站）。
3. 吸出封闭溶液，然后加入稀释后的一抗。
4. 4°C 孵育过夜。

5. 用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。

注： 如果使用荧光物质标记的一抗，则跳转到 Ｃ部分，第 8 步。

6. 用抗体稀释缓冲液将荧光素偶联的二抗稀释后，避光孵育标本 1–2 小时。
7. 用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟，使其避光。

8. 适当的复染。

注： 在您的实验中加入荧光细胞染料（包括 DNA 染料等）时，请参考染料产品页，以了解建议的实验步骤。查看我们的经验证用于免疫荧光分析的细胞染料列表。

9. 在适当的抗荧光衰减试剂如 Prolong^® Gold Antifade Reagent (#9071) 或含 DAPI 的 Prolong^® Gold AntiFade Reagent (#8961)中封片。
10. 为了长期保存，请在 4°C 下避光保存样品。