免疫荧光法（免疫细胞化学）

A. 溶液与试剂

注：用反渗透去离子 (RODI) 水或等效净化水制备溶液。

母液：

• 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS)：( #9808) 要配制 1L 1 X PBS：添加 50 ml 20 X PBS 至 950 ml dH₂O，然后将其混匀。调节 pH 至 8.0。
• 乙醇，70% 溶液，去离子化。
• 1.5 M 盐酸。

• 封闭缓冲液（1X PBS / 5% 正常血清 / 0.3% Triton™ X-100）：

  为配制 10 ml，将 0.5 ml 与二抗同一物种来源的正常血清（例如： Normal Goat Serum ( #5425)) 和0.5mL 20X PBS 添加到 9.0mL dH₂O 中并充分混合。搅拌时加入 30 µl Triton™ X-100。

• 抗体稀释缓冲液 (1X PBS / 1% BSA / 0.3% Triton™ X-100)：To prepare 10 ml, add 30 µl Triton™ X-100 and 0.5 mL 20X PBS to 9.5 mL dH₂O. 充分混合后，添加 0.1 g BSA (#9998)，并混合。

• 建议使用偶联荧光素的抗兔二抗：

  • Anti-Rabbit IgG (H+L)，F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 488 Conjugate) #4412
  • Anti-Rabbit IgG (H+L)，F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 555 Conjugate) #4413
  • Anti-Rabbit IgG (H+L)，F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 594 Conjugate) #8889
  • Anti-Rabbit IgG (H+L)，F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 647 Conjugate) #4414
• Prolong^® Gold AntiFade Reagent (#9071)，Prolong^® Gold AntiFade Reagent with DAPI (#8961)。

B. 标本制备 - 培养细胞系 (IF-IC)

注：用反渗透去离子 (RODI) 水或等效净化水制备溶液。

1. 吸去培养基，用冰冷的 70% 乙醇完全覆盖细胞。
2. 室温下固定细胞 5 分钟。
3. 吸去固定液，用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
4. 加入 1.5 M HCL 后在室温下孵育 30 分钟。
5. 吸去 HCl 后用 1X PBS 洗两次，每次 5 分钟。
6. 继续进行免疫染色 C 部分。

C. 免疫染色

注：所有随后的孵育都应当在室温下完成，除非另外注明需要在潮湿光密盒或带盖的培养皿/板中孵育，以防止干燥和荧光物质淬灭。

1. 在封闭缓冲液中封闭标本 60 分钟。
2. 封闭时，按产品网页中列出的抗体稀释缓冲液中稀释来制备一抗。
3. 吸去封闭缓冲液，加入稀释后的一抗。
4. 4°C 孵育过夜。
5. 用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
6. 用抗体稀释缓冲液将偶联荧光素的二抗稀释后，室温下避光孵育标本 1–2 小时。
7. 用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
8. 在适当的抗荧光衰减试剂如 Prolong^® Gold Antifade Reagent (#9071) 或含 DAPI 的 Prolong^® Gold AntiFade Reagent (#8961)中封片。
9. 要达到最佳效果，使用封片液室温过夜。将切片平放避光 4°C 环境下，可长期保存。