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DNA 点印迹实验步骤

A. 缓冲液和试剂

  1. 20X Saline Sodium Citrate (SSC) Buffer: 3.0 M NaCl, 0.3 M Sodium Citrate, pH to 7.0.
  2. 10X SSC Buffer: Dilute 20X SSC buffer 1:2.
  3. 2X DNA Denaturing Buffer: 200 mM NaOH, 20 mM EDTA.
  4. Nuclease-Free Water: (#12931)
  5. Blotting Membrane: This protocol has been optimized for positively charged nylon membranes.
  6. 96 孔点印迹仪器
  7. 10X Tris Buffered Saline with Tween® 20 (TBST): (#9997) To prepare 1 L 1X TBST: add 100 ml 10X TBST to 900 ml dH2 0, mix.
  8. Nonfat Dry Milk: (#9999)
  9. Blocking Buffer: 1x TBST with 5% w/v nonfat dry milk; for 150 ml, add 7.5 g nonfat dry milk to 150 ml 1X TBST and mix well.
  10. Bovine Serum Albumin (BSA): (#9998)
  11. Primary Antibody Dilution Buffer: 含 5% BSA 的 1X TBST；要制备 20 ml，请添加 1.0 g BSA 至 20 ml 1X TBST，然后混匀。
  12. Secondary Antibody Conjugated to HRP: anti-rabbit (#7074); anti-mouse (#7076).
  13. 检测试剂 LumiGLO®化学发光试剂和过氧化物 (#7003) 或 SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。

B. 点印迹

注：This protocol is written for spotting fragmented, purified genomic DNA (titration of 1000 ng, 500 ng, 250 ng, 125 ng, 62.5 ng, 31.25 ng, and 15.625 ng) onto a positively charged nylon membrane using a 96-well dot blotting apparatus. 根据 DNA 的来源和类型，抗体检测所需的 DNA 数量不一。
开始之前：
• Purify genomic DNA using a genomic DNA purification protocol or kit and sonicate
genomic DNA to generate fragments between 200 and 500 bp. DNA fragment size
can be analyzed by gel electrophoresis on a 1% agarose gel with a 100 bp DNA
marker.
• 将一片尼龙膜切割成点印迹多管吸印仪的尺寸。
• 用 10x SSc 缓冲液润湿尼龙膜。
• 通过在 96 孔点印迹仪中放置尼龙膜并施加真空，使其干燥。

  1. 将片段化的基因组 DNA 在 100 ul 无核酸酶的水中稀释成 100ng/μl。
    随后添加 100 μl 2X DNA 变性缓冲液，并在95° C 孵育 10 分钟，使 DNA 变性。
  2. 添加200 μl 20X SSC 缓冲液，并且立即在冰上速冷 5 分钟。
  3. 添加100 μl 无核酸酶的水以补足 DNA 溶液至终体积 500 μl，DNA 浓度为 20 ng/μl。
  4. 使用步骤 3 中的 DNA 溶液，添加 250 μl DNA 溶液至 250 μl 无核酸酶的水中，建立六份 2 倍连续稀释物。这将产生 7 份250 μl DNA的 DNA 样品，浓度分别为 20 ng/μl、10 ng/μl、5 ng/μl、2.5 ng/μl、1.25 ng/μl、0.625 ng/μl 和0.3125 ng/μl。
  5. 从 7 份稀释物样品中各取 50 μl 至 96 孔点印迹仪的单个孔中，留下最后一孔添加无核酸酶的水。随后，每个孔的 DNA 添加量应分别为 1000 ng、500 ng、250 ng、125 ng、62.5 ng、31.25 ng、15.625 ng 和0 ng。施加柔和真空压力以将溶液过膜引出。尼龙膜在 步骤6 之前应几乎全干。
  6. 从 96 孔点印迹仪取下尼龙膜并且包裹在保鲜膜中。
  7. 在 1200 J/m2处将尼龙膜 UV 交联。

C. 膜封闭和抗体孵育

  1. 将膜在室温于 25 ml 封闭缓冲液中孵育 1 小时，同时温和振荡。
  2. 将膜用 15 ml 1X TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
  3. 将膜和一抗（按照抗体产品数据表中建议的适当稀释度和稀释剂）在4°C 于 10 ml 一抗稀释缓冲液中孵育过夜，同时温和振荡。
  4. 用 15 ml 1X TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
  5. 将膜与合适的 HRP 偶联二抗（#7074 Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody 或 #7076 Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody）按 1:2000 在室温于 10 ml 封闭缓冲液中孵育 1 小时，同时温和振荡。
  6. 将膜用 15 ml 1X TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
  7. 继续进行检测（D 部分）。

D. DNA 的检测

  1. 将膜与 10 mL LumiGLO®（0.5 ml 20x LumiGLO® #7003、0.5 ml 20x 过氧化物和 9.0 ml 净化水）或 10 ml SignalFire™ #6883（5 ml 试剂 A，5 ml 试剂 B）在室温孵育1 分钟，同时温和振荡。
  2. 将膜上多余的显影液沥干（勿令其干燥），包裹在塑料膜中，然后用 X 射线胶片曝光。从刚开始的 10 秒曝光结果中可以看出适当的曝光时间。

注： Due to the kinetics of the detection reaction, signal is most intense immediately following incubation and declines over the following 2 hr

发布​时间 2015 年 11 月