针对非偶联小鼠抗体的活细胞实验步骤（流式细胞术）

A. 溶液与试剂

注：利用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

1. 1X 磷酸盐缓冲盐水（PBS）：配制 1 L 的 1X PBS：add 100 ml 10X PBS (#12528) to 900 ml water mix.
2. 抗体稀释缓冲液：购买即用型流式细胞术抗体稀释缓冲液 (#13616)，或在 100 ml 1x PBS 中溶解 0.5 g 牛血清白蛋白 (BSA) (#9998) 来制备 0.5% BSA PBS 缓冲液。4°C 保存。
3. 建议使用 Anti-Mouse 二抗：
   • Anti-Mouse IgG (H+L), F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 488 Conjugate) #4408
   • Anti-Mouse IgG (H+L), F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 594 Conjugate) #8890
   • Anti-Mouse IgG (H+L), F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 647 Conjugate) #4410
   • Anti-Mouse IgG (H+L), F(ab')₂ Fragment (PE Conjugate) #59997

注：在您的实验中加入荧光细胞染料（包括活性染料、DNA 染料等）时，请参考染料产品页，了解建议的实验步骤。访问 www.cellsignal.com，了解经验证用于流式细胞术的细胞染料完整列表。

B. 免疫染色

注：使用血细胞计数器或备选方法计数细胞。

注：如果使用全血，则需在免疫染色之前裂解红细胞并通过离心分离来洗涤。

注：理想的离心条件根据细胞类型和试剂容量有所不同。一般，1-5 分钟 150-300g 将足以使细胞沉淀下来。

1. 将所需数目的细胞分装入试管或小孔中。（通常，每次测定 5 x 10⁵ 至 1 x 10⁶ 个细胞。）
2. 通过离心使细胞沉淀下来，移除上清液。
3. 在 100 µl 稀释的一抗中重悬细胞，这种一抗按建议的稀释度或如通过滴定所确定那样以抗体稀释缓冲液配制。
4. 在冰上孵育 30 分钟至 1 小时。避光。
5. 用抗体稀释缓冲液进行离心洗涤。弃去上清液。重复。
6. 在 100 µl 稀释的荧光物质偶联的二抗（按建议稀释度用抗体稀释缓冲液制备）中重悬细胞。
7. 在冰上孵育 30 分钟。避光。
8. 用抗体稀释缓冲液进行离心洗涤。弃去上清液。重复。
9. 在 200-500 μl 抗体稀释缓冲液中重悬细胞后用流式细胞分析仪进行分析。