天然蛋白质免疫沉淀法
本实验步骤适用于天然蛋白质免疫沉淀法,进行蛋白质免疫印迹分析或激酶活动分析。
A. 溶液与试剂
注:利用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。
- 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS):(#9808) 要制备 1 L 的 1X PBS,将50 ml 20X PBS 加入到 950 ml dH2O 中,并混匀。
10X 细胞裂解缓冲液:(#9803) To prepare 10 ml of 1X cell lysis buffer, add 1 ml cell lysis buffer to 9 ml dH2O, mix.
注:使用前,立刻加入 1 mM PMSF (#8553)。
- 3X SDS 样品缓冲液:Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) ;通过添加 1/10 体积的 30 X DTT 至 1 体积的 3 X SDS 上样缓冲液,制备新鲜的 3 X 还原上样缓冲液。
- Protein A Agarose Beads: Use Protein A (#9863) for rat IgG immunoprecipitation.
- 10X 激酶缓冲液(激酶测定):(#9802) 要制备 1 ml 的 1X 激酶缓冲液,将 100 µl 10X 激酶缓冲液加入到 900 µl dH2O 中,并混匀。
- ATP (10 mM) (激酶测定):(#9804) 要制备 0.5 ml 的 ATP (200 µM),将 10 µl ATP (10 mM) 加入到 490 µl 1X 激酶缓冲液中。
B. 制备细胞裂解物
- 吸干培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
- 在非变性条件下收集细胞,去除培养基后用冰预冷的 1X PBS 洗涤细胞一次。
- 去除 PBS,每块平板 (10 cm) 添加 0.5 ml 冰冷的 1X 细胞裂解缓冲液,平板放在冰上孵育 5 分钟。
- 从板上刮下细胞,把提取物转移至微量离心管。置于冰上。
- 在冰上进行 3 次超声破碎,每次 5 秒。
- 在 4°C,在 14,000 x g 条件下,微量离心 10 分钟,将上清转移到新管中。上清液即为细胞裂解物。如有必要,裂解物可保存在 –80°C。
C. 免疫沉淀法
细胞裂解物预澄清(可选)
- 涡旋振荡,以混合磁珠。
- 添加 10–30 µl 的 50% Protein A agarose beads 混悬液至 200 µl 细胞裂解物中 (1 mg/ml)。
- 在 4°C 下,旋转孵育 30–60 分钟。
- 4°C 条件下微量离心 10 分钟。将上清转移到新管中。
- 继续以下的免疫沉淀法。
免疫沉淀法
- 将一抗(按产品说明书中推荐的合适稀释比例配制)加入到浓度为 1 mg/ml 200 µl 细胞裂解物中。在 4°C 下,旋转孵育过夜。
- 添加 protein A 琼脂糖(10–30 µl 的 50% 珠浆)。在 4°C 下,旋转孵育 1-3 小时。
- 4°C 条件下微量离心 30 秒。用 500 µl 的 1X 细胞裂解缓冲液,洗涤沉淀物五次。洗涤间期,保持样品于冰上。
- 继续使用蛋白免疫印迹法或激酶活性检测对样品进行分析(D 部分)。
D. 样品分析
继续下述其中一项的具体步骤。
用蛋白免疫印迹法进行分析
- 用 20 µl 3X SDS 样品缓冲液重悬沉淀物。涡旋振荡,然后在 14,000 x g 下瞬时离心 30 秒。
- 将样品加热至 95–100°C 并持续 2-5 分钟,然后在 14,000 x g 下微量离心 1 分钟。
- 对于 SDS-PAGE,将样品 (15–30 µl) 上样至 4–20% 凝胶上。
- 用蛋白质印迹法分析样品(请参阅蛋白质免疫印迹法实验步骤)。
用激酶活性测定法进行分析
- 用 500 µl 1X 激酶缓冲液洗涤沉淀物两次。置于冰上。
- 在 40 µl 1X 激酶缓冲液中悬浮沉淀物,并补充 200 µM ATP 和适当的底物。
- 30°C 条件下孵育 30 分钟。
- 用 20 µl 3X SDS 样品缓冲液终止反应。涡旋振荡,然后再微量离心 30 秒。
- 将含有磷酸化底物的上清转移到另一管中。
- 将样品加热至 95–100°C 并持续 2-5 分钟,然后在 14,000 x g 下微量离心 1 分钟。
- 将样品上样 (15–30 µl) 到 SDS-PAGE (4–20%) 上。
发布时间 2008 年 12 月
修订时间 2013 年 11 月