针对小鼠抗体的甲醇通透实验步骤 （流式细胞术）

A. 溶液与试剂

本实验步骤中所需的所有试剂可与我们的 Intracellular Flow Cytometry Kit (Methanol) #13593 一起高效购买，或使用下文所列的货号单独购买。

注：利用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

1. 1X 磷酸盐缓冲盐水（PBS）：配制 1 L 的 1X PBS：add 100 ml 10X PBS (#12528) to 900 ml water mix.
2. 4% 甲醛，无甲醇 (#47746)
3. 100% 甲醇 (#13604)：使用前先冷却
4. 抗体稀释缓冲液：购买即用型流式细胞术抗体稀释缓冲液 (#13616)，或在 100 ml 1x PBS 中溶解 0.5 g 牛血清白蛋白 (BSA) (#9998) 来制备 0.5% BSA PBS 缓冲液。4°C 保存。
5. 建议使用 Anti-Mouse 二抗：
   • Anti-Mouse IgG (H+L), F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 488 Conjugate) #4408
   • Anti-Mouse IgG (H+L), F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 594 Conjugate) #8890
   • Anti-Mouse IgG (H+L), F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 647 Conjugate) #4410
   • Anti-Mouse IgG (H+L), F(ab')₂ Fragment (PE Conjugate) #8887

注：在您的实验中加入荧光细胞染料（包括活性染料、DNA 染料等）时，请参考染料产品页，了解建议的实验步骤。访问 www.cellsignal.com，了解经验证用于流式细胞术的细胞染料完整列表。

B. 固定

注：固定前，应分离贴壁细胞或组织，使它成为单细胞悬浮液。

注：理想的离心条件根据细胞类型和试剂容量有所不同。一般，1-5 分钟 150-300g 将足以使细胞沉淀下来。

注：如果使用全血，则需在固定前裂解红细胞并通过离心分离来洗涤。

注：如果表位被甲醛和/或甲醇破坏，可以在固定前添加靶向 CD 标记物或其他胞外蛋白的抗体。在固定和透化过程期间，这类抗体将保持与目的靶标结合。但注意，某些荧光团（包括 PE 和 APC）会被甲醇损坏，因此不应在透化前添加。如果您不确定，请进行小规模实验。

1. 通过离心使细胞沉淀下来，移除上清液。
2. 按每 100 万个细胞大约 100 µl 4% 甲醛重悬细胞。混匀以解离沉淀物并防止各个细胞交联。
3. 室温 (20-25°C) 固定 15 分钟。
4. 通过离心用过量 1X PBS 洗涤。将上清液弃于合适的废液缸中。以 0.5-1 ml 1 X PBS 重悬细胞。继续进行透化步骤。
   1. 或者，细胞可在 1X PBS 中 4°C 保存过夜。

C. 透化

1. 通过温和涡旋混合的同时，向预冷的细胞中缓慢添加冰冷的 100% 甲醇至 90​% 甲醇终浓度，使细胞透化。
2. 在冰上透化最短 10 分钟。
3. 继续进行细胞免疫染色（D 部分）或将细胞 在 90% 甲醇中 -20°C 保存。

D. 免疫染色

注：使用血细胞计数器或备选方法计数细胞。

1. 将所需数目的细胞分装入试管或小孔中。（通常，每次测定 5 x 10⁵ 至 1 x 10⁶ 个细胞。）
2. 通过离心以过量 1X PBS 洗涤分离，以去除甲醇。将上清液弃于合适的废液缸中。如有必要，可重复进行。
3. 在 100 µl 稀释的一抗中重悬细胞，这种一抗按建议的稀释度或如通过滴定所确定那样以抗体稀释缓冲液配制。
4. 室温孵育 1 小时。
5. 在抗体稀释缓冲液或 1X PBS 中通过离心洗涤。弃去上清液。重复。
6. 在 100 µl 稀释的荧光物质偶联的二抗（按建议稀释度用抗体稀释缓冲液制备）中重悬细胞。
7. 室温孵育 30 分钟。避光。
8. 在抗体稀释缓冲液或 1X PBS 中通过离心洗涤。弃去上清液。重复。
9. 在 200-500 µl 1X PBS 中重悬细胞，并在流式细胞分析仪上分析。