针对小鼠抗体的胞外表位实验步骤 （流式细胞术）

A. 溶液与试剂

注：利用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

1. 1X 磷酸盐缓冲盐水（PBS）：配制 1 L 的 1X PBS：添加 100 ml 10X PBS (#12528) 至 900 ml 水，然后将其混合。
2. 4% 甲醛，不含甲醇 (#47746)，可选
3. 抗体稀释缓冲液：Purchase ready-to-use Flow Cytometry Antibody Dilution Buffer (#13616), or prepare a 0.5% BSA PBS buffer by dissolving 0.5 g Bovine Serum Albumin (BSA) (#9998) in 100 ml 1X PBS. 4°C 保存。
4. 建议的抗小鼠二抗：
   • Anti-Mouse IgG (H+L)，F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 488 Conjugate)#4408
   • Anti-Mouse IgG (H+L)，F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 594 Conjugate)#8890
   • Anti-Mouse IgG (H+L)，F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 647 Conjugate)#4410
   • Anti-Mouse IgG (H+L)，F(ab')₂ Fragment (PE Conjugate)#59997

注：在您的实验中加入荧光细胞染料（包括活性染料、DNA 染料等）时，请参考染料产品页，了解建议的实验步骤。访问 www.cellsignal.com，了解经验证用于流式细胞术的细胞染料完整列表。

注：理想的离心条件根据细胞类型和试剂容量有所不同。一般，1-5 分钟 150-300g 将足以使细胞沉淀下来。

B. 固定

注：If live cell staining is desired, proceed to Section C.

1. 通过离心使细胞沉淀下来，移除上清液。
2. 按每 100 万个细胞大约 100 µl 4% 甲醛重悬细胞。混匀以解离沉淀物并防止各个细胞交联。
3. 室温 (20-25°C) 固定 15 分钟。
4. 通过离心用过量 1X PBS 洗涤。将上清液弃于合适的废液缸中。在 1X PBS 中重悬细胞。

C. 免疫染色

注：使用血细胞计数器或备选方法计数细胞。

1. 将所需数目的细胞分装入试管或小孔中。（通常，每次测定 5 x 10⁵ 至 1 x 10⁶ 个细胞。）
2. 通过离心使细胞沉淀下来，移除上清液。
3. 在 100 µl 稀释的一抗（按照建议的稀释度用抗体稀释缓冲液制备）中重悬细胞。
4. 在室温 (20-25°C) 下孵育 30-60 分钟。
5. 用抗体稀释缓冲液进行离心洗涤。弃去上清液。重复。
6. 在 100 µl 稀释的荧光素偶联的二抗（按照建议的稀释度用抗体稀释缓冲液制备）中重悬细胞。
7. 在室温孵育 30 分钟。
8. 通过离心分离，用孵育缓冲液洗涤。弃去上清液。重复。
9. 在 200-500 µl 1X PBS 中重悬细胞，并在流式细胞分析仪上分析。