用于需要 2% 甲醛固定和 0.1% Triton™ X-100 透化的细胞检测的免疫荧光实验步骤
重要事项:This protocol employs an atypical fixation and permeabilization strategy with which only certain targets are compatible. 在适当的情况下,该实验步骤将在特定于产品的网页上的“产品信息”横幅下链接至其经过验证的抗体。
A. 溶液与试剂
注:用反渗透去离子 (RODI) 水或等效净化水制备溶液。
- 1X 磷酸盐缓冲盐水(PBS):要配制 1 L 1X PBS:添加 100 ml 10X 洗涤缓冲液、磷酸盐缓冲盐水 (#12528) 到 900 ml dH2O 中,混匀。调节 pH 至 8.0。
- 2% Formaldehyde, Methanol-Free: To prepare 10 mL, add 1.25 mL 16% Formaldehyde, Methanol-Free (#12606) to 8.75 mL 1X PBS and mix well. 使用前准备新鲜溶液。
- Blocking Buffer (1X PBS / 5% normal serum / 0.1% Triton™ X-100): To prepare 10 mL, add 0.5 mL normal serum from the same species as the secondary antibody (e.g., Normal Goat Serum (#5425)) and 10 µL Triton™ X-100 to 9.5 mL 1X PBS. 4°C 保存。
- Antibody Dilution Buffer (1X PBS / 0.1% Triton™ X-100): To prepare 10 mL, add 10 µL Triton™ X-100 to 10 mL 1X PBS. 4°C 保存。
- Fluorochrome-conjugated Secondary Antibody: 使用对您的一抗宿主物种(例如兔子)具有反应性的二抗。单击此处获得批准用于免疫荧光法的二抗列表。
B. 固定
注:所有后续孵育都应在室温(20-25°C)下进行, 除非另有说明。
- 然后吸出培养基,用 2% 的甲醛将细胞覆盖到 2 – 3 mm 的深度。
- 可让细胞固定15分钟。
- 用 1X PBS 漂洗三次,每次 5 分钟。
- 继续进行免疫染色操作(C 部分)。
C. 免疫染色
- 在封闭缓冲液中封闭标本 60 分钟。
- 封闭时,在抗体稀释缓冲液中制备一抗(建议的稀释范围请参见产品网站)。
- 吸出封闭溶液,然后加入稀释后的一抗。
- 4°C 孵育过夜。
- 用 1X PBS 漂洗三次,每次 5 分钟。
- 用抗体稀释缓冲液将荧光素偶联的二抗稀释后,避光孵育标本 1–2 小时。
- 用 1X PBS 漂洗三次,每次 5 分钟,使其避光。
- 适当的复染。
注:在您的实验中加入荧光细胞染料(包括 DNA 染料等)时,请参考染料产品页,以了解建议的实验步骤。查看我们的经验证用于免疫荧光分析的细胞染料列表。
- 安装样品进行成像。
- 为了长期保存,请在 4°C 下避光保存样品。