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用于需要 2% 甲醛固定和 0.1% Triton™ X-100 透化的细胞检测的免疫荧光实验步骤

重要事项：This protocol employs an atypical fixation and permeabilization strategy with which only certain targets are compatible. 在适当的情况下，该实验步骤将在特定于产品的网页上的“产品信息”横幅下链接至其经过验证的抗体。

A. 溶液与试剂

注：用反渗透去离子 (RODI) 水或等效净化水制备溶液。

  1. 1X 磷酸盐缓冲盐水（PBS）：要配制 1 L 1X PBS：添加 100 ml 10X 洗涤缓冲液、磷酸盐缓冲盐水 (#12528) 到 900 ml dH2O 中，混匀。调节 pH 至 8.0。
  2. 2% Formaldehyde, Methanol-Free: To prepare 10 mL, add 1.25 mL 16% Formaldehyde, Methanol-Free (#12606) to 8.75 mL 1X PBS and mix well. 使用前准备新鲜溶液。
  3. Blocking Buffer (1X PBS / 5% normal serum / 0.1% Triton™ X-100): To prepare 10 mL, add 0.5 mL normal serum from the same species as the secondary antibody (e.g., Normal Goat Serum (#5425)) and 10 µL Triton™ X-100 to 9.5 mL 1X PBS. 4°C 保存。
  4. Antibody Dilution Buffer (1X PBS / 0.1% Triton™ X-100): To prepare 10 mL, add 10 µL Triton™ X-100 to 10 mL 1X PBS. 4°C 保存。
  5. Fluorochrome-conjugated Secondary Antibody: 使用对您的一抗宿主物种（例如兔子）具有反应性的二抗。单击此处获得批准用于免疫荧光法的二抗列表。

B. 固定

注：所有后续孵育都应在室温（20-25°C）下进行， 除非另有说明。

  1. 然后吸出培养基，用 2％ 的甲醛将细胞覆盖到 2 – 3 mm 的深度。
  2. 可让细胞固定15分钟。
  3. 用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
  4. 继续进行免疫染色操作（C 部分）。

C. 免疫染色

  1. 在封闭缓冲液中封闭标本 60 分钟。
  2. 封闭时，在抗体稀释缓冲液中制备一抗（建议的稀释范围请参见产品网站）。
  3. 吸出封闭溶液，然后加入稀释后的一抗。
  4. 4°C 孵育过夜。
  5. 用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
  6. 用抗体稀释缓冲液将荧光素偶联的二抗稀释后，避光孵育标本 1–2 小时。
  7. 用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟，使其避光。
  8. 适当的复染。

    注：在您的实验中加入荧光细胞染料（包括 DNA 染料等）时，请参考染料产品页，以了解建议的实验步骤。查看我们的经验证用于免疫荧光分析的细胞染料列表。

  9. 安装样品进行成像。
  10. 为了长期保存，请在 4°C 下避光保存样品。