免疫荧光法（免疫细胞化学）

A. 溶液与试剂

注：用反渗透去离子 (RODI) 水或等效净化水制备溶液。

1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS)： (9808) To prepare 1L 1X PBS: 添加 50 ml 20 X PBS 至 950 ml dH₂O，然后将其混匀。调节 pH 至 8.0。
2. 甲醛：16%, methanol free, Polysciences, Inc. (cat# 18814), use fresh and store opened vials at 4°C in dark, dilute in 1X PBS for use.
3. 甲醇，100%
4. 封闭缓冲液（1X PBS / 5% 正常血清 / 0.3% Triton™ X-100）：为配制 10 ml，将 0.5 ml 与二抗同一物种来源的正常血清（例如： Normal Goat Serum ( #5425)) 和0.5mL 20X PBS 添加到 9.0mL dH₂O 中并充分混合。搅拌时加入 30 µl Triton™ X-100。
5. 抗体稀释缓冲液 (1X PBS / 1% BSA / 0.3% Triton X-100)：准备 10 ml 溶液，添加 30 µl Triton™ X-100 到 10 ml 1X PBS 中。充分混合后，添加 0.1 g BSA (9998)，并混合。

6. 建议使用偶联荧光素的抗兔二抗：

   • Anti-Rabbit IgG (H+L)，F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 488 Conjugate) #4412
   • Anti-Rabbit IgG (H+L)，F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 555 Conjugate) #4413
   • Anti-Rabbit IgG (H+L)，F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 594 Conjugate) #8889
   • Anti-Rabbit IgG (H+L)，F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 647 Conjugate) #4414
7. Prolong^® Gold AntiFade Reagent (#9071)，Prolong^® Gold AntiFade Reagent with DAPI (#8961)。

B. 标本制备 - 培养细胞系 (IF-IC)

注：细胞应当在多孔板、腔室玻片或盖玻片上直接培养、处理、固定和染色。

1. 吸干液体，随后在细胞上覆盖一层 2–3 mm 用 1X PBS 稀释的 4% 甲醛。
   注：甲醛有毒性，仅限在通风橱中使用。
2. 室温下固定细胞 15 分钟。
3. 吸去固定液，用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
4. 继续进行免疫染色操作（C 部分）。

C. 免疫染色

注：所有随后的孵育都应当在室温下完成，除非另外注明需要在潮湿光密盒或带盖的培养皿/板中孵育，以防止干燥和荧光物质淬灭。

1. 甲醇通透化步骤： Cover cells with ice-cold 100% methanol (use enough to cover completely to a depth of 3–5 mm, DO NOT LET DRY), incubate in methanol for 10 minutes at –20°C, rinse in 1X PBS for 5 minutes.
2. 在封闭缓冲液中封闭标本 60 分钟。
3. 封闭时，按产品网页中列出的抗体稀释缓冲液中稀释来制备一抗。
4. 吸去封闭缓冲液，加入稀释后的一抗。
5. 4°C 温度下孵育过夜。
6. 用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
7. 用抗体稀释缓冲液将偶联荧光素的二抗稀释后，室温下避光孵育标本 1–2 小时。
8. 按步骤 6 使用 1X PBS 漂洗。
9. 使用 Prolong^® Gold Antifade Reagent (#9071) 以及带 DAPI (#8961) 的 Prolong^® Gold AntiFade Reagent 盖住切片。
10. 为达到最佳效果，立即以适当的激发波长检测标本。将切片平放避光 4°C 环境下，可长期保存。