免疫组织化学（石蜡）

A. 溶液与试剂

注：利用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

1. 二甲苯。
2. 无水变性乙醇，组织级（100% 和 95%）。
3. 去离子水 (dH₂O)。
4. 苏木精（可选）。
5. 洗涤缓冲液：
   1. 1X Tris Buffered Saline with Tween^® 20 (TBST)：要制备 1L 1X TBST，添加 100 ml 含 Tween^® 的 2010 X Tris 盐缓冲液 (#9997) 至 900 ml dH ₂0，然后进行搅拌。
6. 1X Phosphate Buffered Saline with Tween® 20 Antibody Diluent: To prepare 5 mL of 1X PBST, dilute 250 µl of Phosphate Buffered Saline with Tween^® 20 (PBST-20X) (#9809) with 5 mL dH₂O.
7. 1X EDTA 修复液：To prepare 250 mL of 1X EDTA unmasking solution, dilute 25 ml of SignalStain^® EDTA Unmasking Solution (10X) (#14746) with 225 mL of dH₂O.
8. 3% 过氧化氢：要制备 100 ml 溶液，将 10 ml 30% H₂O₂ 加入到 90 ml dH₂O 中。
9. 封闭液：TBST/5% Normal Goat Serum 或 1X Animal-Free Blocking Solution。
   1. TBST/5% Normal Goat Serum：向 5 ml 1X TBST 中添加 250 µl Normal Goat Serum (#5425)。
   2. 1X Animal-Free Blocking Solution：在 4 mL 的 dH₂O 中，加入 1 ml 的 Animal-Free Blocking Solution (5X) (#15019)。
10. 检测系统：SignalStain^® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Rabbit #8114)。
11. 基质：SignalStain^® DAB Substrate Kit (#8059)。
12. Hematoxylin（苏木精）‭： Hematoxylin(#14166)。
13. 封片剂： SignalStain^® Mounting Medium (#84583)。

B. 脱蜡/复水

注：务必使切片在制作过程中始终保持湿润状态。

1. 脱蜡/水化合步骤：
   1. 将切片放入二甲苯的洗液中孵育 3 次，每次 5 分钟。
   2. 将切片放入 100% 乙醇中孵育切片 2 次，每次 10 分钟。
   3. 将切片放入 95% 乙醇中孵育切片 2 次，每次 10 分钟。
2. 用 dH₂O 清洗切片两次，每次 5 分钟。

C. 抗原修复

对于 EDTA：Heat slides in a microwave submersed in 1X EDTA unmasking solution until boiling is initiated; follow with 15 min at a sub-boiling temperature (95°-98°C). 无需冷却。

D. 染色

1. 用 dH₂O 清洗切片三次，每次 5 分钟。
2. 切片放入 3 % 过氧化氢水溶液中，孵育 10 分钟。
3. 用 dH₂O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 用洗涤缓冲液清洗切片持续 5 分钟。
5. 使用 100–400 µl 封闭液将每张切片在室温下封闭 1 小时。
6. Remove blocking solution and add 100–400 µl primary antibody diluted in 1X Phosphate Buffered Saline with Tween® 20 Antibody Diluent (#9809) to each section. 4°C 孵育过夜。
7. 使 SignalStain^® Boost Detection Reagent (HRP, Rabbit #8114) 平衡至室温。
8. 清除抗体溶液，用洗涤缓冲液清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
9. 根据需要在切片上滴 1–3 滴 SignalStain^® Boost Detection Reagent (HRP, Rabbit #8114)。在加湿箱中室温孵育 30 分钟。
10. 用洗涤缓冲液清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
11. 加入 1 滴 (30 µl) SignalStain^® DAB Chromogen Concentrate 至 1 ml 的 SignalStain^® DAB Diluent 中，使用前充分混合。
12. 在每张切片上加 100–400 µl SignalStain^® DAB，并密切观察，通常 5–10 分钟即可得到合适的染色强度。
13. 将切片浸入 dH₂O 中。
14. 如果需要，使用 hematoxylin (#14166) 复染切片。
15. 用 dH₂O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
16. 使切片脱水：
    1. 在 95% 乙醇中孵育切片 2 次，每次 10 秒。
    2. 在 100% 乙醇中重复孵育 2 次，每次 10 秒。
    3. 在二甲苯中重复孵育 2 次，每次 10 秒。
17. 使用盖玻片和封片剂 (#84583) 封片。

注：Use of detection reagents other than those specified in this protocol may require further optimization of the primary antibody to account for the different sensitivities of the detection reagents.