免疫组织化学(石蜡)
A. 溶液与试剂
- 二甲苯
- 乙醇,无水变性,组织学分级(100% 和 95%)
- 去离子水 (dH2O)
- Hematoxylin(可选)
- 洗涤缓冲液:
- 1X Tris Buffered Saline with Tween® 20 (TBST):要制备 1L 1X TBST,添加 100 ml 含 Tween® 的 2010 X Tris 盐缓冲液 (#9997) 至 900 ml dH 20,然后进行搅拌。
- SignalStain® Antibody Diluent (#8112)。
- 1X 柠檬酸盐修复液:要制备 250 ml 的 1X 柠檬酸盐修复液,将 25 ml 的 SignalStain® Citrate Unmasking Solution (10X) (#14746) 用 225 ml 的 dH2O 进行稀释。
- 3% 过氧化氢: 要制备,添加 10 ml 30% H2O2 到 90 ml dH2O 中。
- 封闭液:TBST/5% Normal Goat Serum 或 1X Animal-Free Blocking Solution。
- 检测系统: VECTASTAIN® Elite ABC, including biotinylated secondary antibody (Vector Laboratories).
- 基质:Vector® NovaRED™ (Vector Laboratories).
- Hematoxylin(苏木精): Hematoxylin(#14166)。
- 封片剂: SignalStain® Mounting Medium (#84583)。
B. 脱蜡/复水
注:务必使切片在制作过程中始终保持湿润状态。
- 脱蜡/水化合步骤:
- 将切片放入二甲苯的洗液中孵育 3 次,每次 5 分钟。
- 将切片放入 100 乙醇中孵育切片 2 次,每次 10 分钟。
- 将切片放入 95 乙醇中孵育切片 2 次,每次 10 分钟。
- 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。
C. 抗原修复
对于柠檬酸盐:把切片浸入 1X 柠檬酸盐修复液中后放入微波炉中加热,直至开始沸腾;随后使之在亚沸温度 (95°-98°C) 下保持 10 分钟。在实验台上冷却切片 30 分钟。
D. 染色
- 用 dH2O 清洗切片三次,每次 5 分钟。
- 切片放入 3% 过氧化氢水溶液中,孵育 10 分钟。
- 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。
- 用洗涤缓冲液清洗切片持续 5 分钟。
- 在每个切片上滴加 100–400 µl 首选封闭液,在室温下封闭 1 小时。
- 除去封闭液,并给每块切片添加 100-400 µl 在 SignalStain® Antibody Diluent (#8112) 中稀释过的一抗。4°C 温度下孵育过夜。
- 根据制造商建议说明制备 ABC 溶液。
- 清除一抗,用洗涤缓冲液清洗切片 3 次,每次 5 分钟。
- 将每个切片中添加 100-400 µl 生物素化二抗(根据制造商建议在 TBST 中进行稀释)。在室温孵育 30 分钟。
- 清除二抗溶液,用洗涤缓冲液清洗切片 3 次,每次 5 分钟。
- 按需使用 100-400 µl 预混合 ABC 溶液覆盖切片,并在湿盒中室温孵育 30 分钟。
- 用洗涤缓冲液清洗切片 3 次,每次 5 分钟。
- 根据制造商建议说明制备 Vector® NovaRED™。
- 在每张切片上应用 100–400 µl 底物并密切观察,通常 1-10 分钟即可得到合适的染色强度。
- 如果需要,使用 hematoxylin (#14166) 复染切片。
- 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。
- 使切片脱水:
- 在 95% 乙醇中孵育切片 2 次,每次 10 秒。
- 在 100% 乙醇中重复孵育 2 次,每次 10 秒。
- 在二甲苯中重复孵育 2 次,每次 10 秒。
- 使用盖玻片和封片剂 (#84583) 封片。
建议 检测试剂 |
SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Rabbit) #8114 | SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (AP, Rabbit) #18653 |
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兼容 色原 |
SignalStain® DAB Substrate Kit #8059 | SignalStain® Vibrant Red Alkaline Phosphatase Substrate Kit #76713 |
SignalStain® Vivid Purple Peroxidase Substrate Kit #96632 |
注:Use of detection reagents other than those specified in this protocol may require further optimization of the primary antibody to account for the different sensitivities of the detection reagents.
发布时间 2005 年 6 月
修订时间 2020 年 6 月