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免疫组织化学(石蜡)

A. 溶液与试剂

  1. 二甲苯
  2. 乙醇,无水变性,组织学分级(100% 和 95%)
  3. 去离子水 (dH2O)
  4. Hematoxylin(可选)
  5. 洗涤缓冲液
    1. 1X Tris Buffered Saline with Tween® 20 (TBST):要制备 1L 1X TBST,添加 100 ml 含 Tween® 的 2010 X Tris 盐缓冲液 (#9997) 至 900 ml dH 20,然后进行搅拌。
  6. SignalStain® Antibody Diluent (#8112)。
  7. 1X 柠檬酸盐修复液:要制备 250 ml 的 1X 柠檬酸盐修复液,将 25 ml 的 SignalStain® Citrate Unmasking Solution (10X) (#14746) 用 225 ml 的 dH2O 进行稀释。
  8. 3% 过氧化氢: 要制备,添加 10 ml 30% H2O2 到 90 ml dH2O 中。
  9. 封闭液:TBST/5% Normal Goat Serum 或 1X Animal-Free Blocking Solution。
    1. TBST/5% Normal Goat Serum:向 5 ml 1X TBST 中添加 250 µl Normal Goat Serum (#5425)。
    2. 1X Animal-Free Blocking Solution:向 4 mL dH2O 中添加 1 ml Animal-Free Blocking Solution (5X) (#15019)。
  10. 检测系统: VECTASTAIN® Elite ABC, including biotinylated secondary antibody (Vector Laboratories).
  11. 基质:Vector® NovaRED™ (Vector Laboratories).
  12. Hematoxylin(苏木精)‭: Hematoxylin(#14166)。
  13. 封片剂: SignalStain® Mounting Medium (#84583)。

B. 脱蜡/复水

:务必使切片在制作过程中始终保持湿润状态。

  1. 脱蜡/水化合步骤:
    1. 将切片放入二甲苯的洗液中孵育 3 次,每次 5 分钟。
    2. 将切片放入 100 乙醇中孵育切片 2 次,每次 10 分钟。
    3. 将切片放入 95 乙醇中孵育切片 2 次,每次 10 分钟。
  2. 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。

C. 抗原修复

对于柠檬酸盐:把切片浸入 1X 柠檬酸盐修复液中后放入微波炉中加热,直至开始沸腾;随后使之在亚沸温度 (95°-98°C) 下保持 10 分钟。在实验台上冷却切片 30 分钟。

D. 染色

  1. 用 dH2O 清洗切片三次,每次 5 分钟。
  2. 切片放入 3% 过氧化氢水溶液中,孵育 10 分钟。
  3. 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。
  4. 用洗涤缓冲液清洗切片持续 5 分钟。
  5. 在每个切片上滴加 100–400 µl 首选封闭液,在室温下封闭 1 小时。
  6. 除去封闭液,并给每块切片添加 100-400 µl 在 SignalStain® Antibody Diluent (#8112) 中稀释过的一抗。4°C 温度下孵育过夜
  7. 根据制造商建议说明制备 ABC 溶液。
  8. 清除一抗,用洗涤缓冲液清洗切片 3 次,每次 5 分钟。
  9. 将每个切片中添加 100-400 µl 生物素化二抗(根据制造商建议在 TBST 中进行稀释)。在室温孵育 30 分钟。
  10. 清除二抗溶液,用洗涤缓冲液清洗切片 3 次,每次 5 分钟。
  11. 按需使用 100-400 µl 预混合 ABC 溶液覆盖切片,并在湿盒中室温孵育 30 分钟。
  12. 用洗涤缓冲液清洗切片 3 次,每次 5 分钟。
  13. 根据制造商建议说明制备 Vector® NovaRED™。
  14. 在每张切片上应用 100–400 µl 底物并密切观察,通常 1-10 分钟即可得到合适的染色强度。
  15. 如果需要,使用 hematoxylin (#14166) 复染切片。
  16. 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。
  17. 使切片脱水:
    1. 在 95% 乙醇中孵育切片 2 次,每次 10 秒。
    2. 在 100% 乙醇中重复孵育 2 次,每次 10 秒。
    3. 在二甲苯中重复孵育 2 次,每次 10 秒。
  18. 使用盖玻片和封片剂 (#84583) 封片。

检测试剂/底物兼容性
建议
检测试剂
SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Rabbit) #8114 SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (AP, Rabbit) #18653
兼容
色原
SignalStain® DAB Substrate Kit #8059 SignalStain® Vibrant Red Alkaline Phosphatase Substrate Kit #76713
SignalStain® Vivid Purple Peroxidase Substrate Kit #96632  

注:Use of detection reagents other than those specified in this protocol may require further optimization of the primary antibody to account for the different sensitivities of the detection reagents.


发布​时间 2005 年 6 月

修订时间 2020 年 6 月