免疫荧光法（免疫细胞化学）

A. 溶液与试剂

注：用反渗透去离子 (RODI) 水或等效净化水制备溶液。

1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS)：( #9808) 要配制 1L 1 X PBS：添加 50 ml 20 X PBS 至 950 ml dH₂O，然后将其混匀。调节 pH 至 8.0。
2. 甲醛：16%, Methanol-Free, Polysciences, Inc. (cat# 18814), use fresh and store opened vials at 4°C in dark, dilute in 1X PBS for use.
3. 甲醇：100%
4. Blocking Buffer:(1X PBS / 5% normal serum / 0.3% Triton^™ X-100): 为配制 10 ml，将 0.5 ml 与二抗同一物种来源的正常血清（例如： Normal Goat Serum ( #5425)) 和0.5mL 20X PBS 添加到 9.0mL dH₂O 中并充分混合。搅拌的同时，添加 30 µl Triton^™ X-100。
5. Antibody Dilution Buffer (1X PBS / 0.3% Triton X-100): To prepare 10 ml, add 30 µl Triton^™ X-100 to 10 ml 1X PBS. 混匀。
6. 建议使用荧光物质标记的 Anti-Rabbit 二抗：
   • Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) #4412
   • Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 555 Conjugate) #4413
   • Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 594 Conjugate) #8889
   • Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 647 Conjugate) #4414
7. Prolong^® Gold AntiFade Reagent (#9071)、含 DAPI 的 Prolong^® Gold AntiFade Reagent (#8961)。

B. 标本制备 - 培养细胞系 (IF-IC)

注：细胞应当在多孔板、腔室玻片或盖玻片上直接培养、处理、固定和染色。

1. Aspirate liquid, then cover cells to a depth of 2-3 mm with 4% formaldehyde in 1X PBS. 注：甲醛有毒性，仅限在通风橱中使用。
2. 室温下固定细胞 15 分钟。
3. 吸去固定液，用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
4. 继续进行免疫染色操作（C 部分）。

C. 免疫染色

注：所有随后的孵育都应当在室温下完成，除非另外注明需要在潮湿光密盒或带盖的培养皿/板中孵育，以防止干燥和荧光物质淬灭。

1. Methanol Permeabilization Step: Cover cells with ice-cold 100% methanol (use enough to cover completely to a depth of 3-5 mm, DO NOT LET DRY), incubate in methanol for 10 minutes at -20°C, rinse in 1X PBS for 5 minutes.
2. 在封闭缓冲液中封闭标本 60 分钟。
3. 封闭时，按产品网页中列出的抗体稀释缓冲液中稀释来制备一抗。
4. 吸去封闭缓冲液，加入稀释后的一抗。
5. 4°C 孵育过夜。
6. 用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
7. Incubate specimen in fluorochrome-conjugated secondary antibody diluted in Antibody Dilution Buffer for 1-2 hours at room temperature in dark.
8. 按步骤 6 使用 1X PBS 漂洗。
9. 使用 Prolong^® Gold Antifade Reagent (#9071) 以及带 DAPI (#8961) 的 Prolong^® Gold AntiFade Reagent 盖住切片。
10. 为达到最佳效果，立即以适当的激发波长检测标本。将切片平放避光 4°C 环境下，可长期保存。