免疫组织化学(石蜡)
A. 溶液与试剂
注:利用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。
- 二甲苯。
- 无水变性乙醇,组织级(100% 和 95%)。
- 去离子水 (dH2O)。
- 苏木精(可选)。
- 洗涤缓冲液:
- 1X EDTA 修复液:To prepare 250 mL of 1X EDTA unmasking solution, dilute 25 ml of SignalStain® EDTA Unmasking Solution (10X) (#14747) with 225 mL of dH2O.
- 3% 过氧化氢:要制备 100 ml 溶液,将 10 ml 30% H2O2 加入到 90 ml dH2O 中。
- 封闭液:TBST/5% Normal Goat Serum 或 1X Animal-Free Blocking Solution。
- 检测系统:SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Rabbit #8114)。
- 基质:Vector® NovaRED™ (Vector Laboratories).
- Hematoxylin(苏木精): Hematoxylin(#14166)。
- 封片剂: SignalStain® Mounting Medium (#84583)。
B. 脱蜡/复水
注:务必使切片在制作过程中始终保持湿润状态。
- 脱蜡/水化合步骤:
- 将切片放入二甲苯的洗液中孵育 3 次,每次 5 分钟。
- 将切片放入 100% 乙醇中孵育切片 2 次,每次 10 分钟。
- 将切片放入 95% 乙醇中孵育切片 2 次,每次 10 分钟。
- 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。
C. 抗原修复
对于 EDTA:Heat slides in a microwave submersed in 1X EDTA unmasking solution until boiling is initiated; follow with 15 min at a sub-boiling temperature (95°-98°C). 无需冷却。
D. 染色
- 用 dH2O 清洗切片三次,每次 5 分钟。
- 切片放入 3 % 过氧化氢水溶液中,孵育 10 分钟。
- 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。
- 用洗涤缓冲液清洗切片持续 5 分钟。
- 使用 100–400 µl 封闭液将每张切片在室温下封闭 1 小时。
- 清除封闭液,然后每个切片加入用推荐的抗体稀释剂稀释的 100–400 µl 的一抗。4°C 孵育过夜。
- 使 SignalStain® Boost Detection Reagent (HRP, Rabbit #8114) 平衡至室温。
- 清除抗体溶液,用洗涤缓冲液清洗切片 3 次,每次 5 分钟。
- 根据需要在切片上滴 1–3 滴 SignalStain® Boost Detection Reagent (HRP, Rabbit #8114)。在加湿箱中室温孵育 30 分钟。
- 用洗涤缓冲液清洗切片 3 次,每次 5 分钟。
- 根据制造商建议说明制备 Vector® NovaRED™。
- 在每张切片上应用 100–400 µl 底物并密切观察,通常 1-10 分钟即可得到合适的染色强度。
- 将切片浸入 dH2O 中。
- 如果需要,使用 hematoxylin (#14166) 复染切片。
- 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。
- 使切片脱水:
- 在 95% 乙醇中孵育切片 2 次,每次 10 秒。
- 在 100% 乙醇中重复孵育 2 次,每次 10 秒。
- 在二甲苯中重复孵育 2 次,每次 10 秒。
- 使用盖玻片和封片剂 (#84583) 封片。
发布时间 2010 年 2 月
修订时间 2016 年 3 月