免疫荧光法(免疫细胞化学)
A. 溶液与试剂
注:用反渗透去离子 (RODI) 水或等效净化水制备溶液。
- 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS): (9808) To prepare 1L 1X PBS: 添加 50 ml 20 X PBS 至 950 ml dH2O,然后将其混匀。调节 pH 至 8.0。
- 甲醇,100%
- 封闭缓冲液(1X PBS / 5% 正常血清 / 0.3% Triton™ X-100):为配制 10 ml,将 0.5 ml 与二抗同一物种来源的正常血清(例如: Normal Goat Serum ( #5425)) 和0.5mL 20X PBS 添加到 9.0mL dH2O 中并充分混合。搅拌时加入 30 µl Triton™ X-100。
- 抗体稀释缓冲液 (1X PBS / 1% BSA / 0.3% Triton X-100):准备 10 ml 溶液,添加 30 µl Triton™ X-100 到 10 ml 1X PBS 中。充分混合后,添加 0.1 g BSA (9998),并混合。
建议使用偶联荧光素的抗兔二抗:
- Prolong® Gold AntiFade Reagent (#9071),Prolong® Gold AntiFade Reagent with DAPI (#8961)。
B. 标本制备 - 培养细胞系 (IF-IC)
注:细胞应当在多孔板、腔室玻片或盖玻片上直接培养、处理、固定和染色。
- 吸干液体,随后在细胞上覆盖一层 2–3 mm 冰冷的 100% 甲醇。
- 在 -20°C 温度下,可让细胞固定15分钟。
- 吸去固定液,用 1X PBS 漂洗三次,每次 5 分钟。
- 继续进行免疫染色操作(C 部分)。
C. 免疫染色
注:所有随后的孵育都应当在室温下完成,除非另外注明需要在潮湿光密盒或带盖的培养皿/板中孵育,以防止干燥和荧光物质淬灭。
- 在封闭缓冲液中封闭标本 60 分钟。
- 封闭时,按产品网页中列出的抗体稀释缓冲液中稀释来制备一抗。
- 吸去封闭缓冲液,加入稀释后的一抗。
- 4°C 温度下孵育过夜。
- 用 1X PBS 漂洗三次,每次 5 分钟。
- 用抗体稀释缓冲液将偶联荧光素的二抗稀释后,室温下避光孵育标本 1–2 小时。
- 按步骤 5 使用 1X PBS 漂洗。
- 使用 Prolong® Gold Antifade Reagent (#9071) 以及带 DAPI (#8961) 的 Prolong® Gold AntiFade Reagent 盖住切片。
- 为达到最佳效果,应立即采用适当的激发波长检测标本。将切片平放避光 4°C 环境下,可长期保存。
发布时间 2010 年 12 月