流式细胞术，无 BSA 的甲醇透化实验步骤

A. 溶液与试剂

注：利用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

1. 1X 磷酸盐缓冲盐水（PBS）：配制 1 L 的 1X PBS：add 100 ml 10X PBS (#12528) to 900 ml water mix.
2. 4% 甲醛，无甲醇 (#47746)
3. 100% 甲醇 (#13604)：Chill before use.

注：在您的实验中加入荧光细胞染料（包括活性染料、DNA 染料等）时，请参考染料产品页，了解建议的实验步骤。

B. 固定

注：固定前，应分离贴壁细胞或组织，使它成为单细胞悬浮液。

注：理想的离心条件根据细胞类型和试剂容量有所不同。一般，1-5 分钟 150-300g 将足以使细胞沉淀下来。

注：如果使用全血，则需在固定前裂解红细胞并通过离心分离来洗涤。

注：如果表位被甲醛和/或甲醇破坏，可以在固定前添加靶向 CD 标记物或其他胞外蛋白的抗体。在固定和透化过程期间，这类抗体将保持与目的靶标结合。但注意，某些荧光团（包括 PE 和 APC）会被甲醇损坏，因此不应在透化前添加。如果您不确定，请进行小规模实验。

1. 通过离心使细胞沉淀下来，移除上清液。
2. 按每 100 万个细胞大约 100 µl 4% 甲醛重悬细胞。混匀以解离沉淀物并防止各个细胞交联。
3. 室温 (20-25°C) 固定 15 分钟。
4. 通过离心用过量 1X PBS 洗涤。将上清液弃于合适的废液缸中。继续进行透化步骤。
   1. 或者，细胞可在 1X PBS 中 4°C 保存过夜。

C. 透化

1. 通过温和涡旋混合的同时，向预冷的细胞中缓慢添加冰冷的 100% 甲醇至 90​% 甲醇终浓度，使细胞透化。
   1. 如果容器体积有限（例如，96 孔板中），则通过与适当体积的 1X PBS 混合生成 90% 甲醇溶液。使细胞沉淀并丢弃上清液，然后添加 100 μl 90% 甲醇至细胞。确保细胞沉淀物充分解离。
2. 在冰上透化最短 10 分钟。
3. 继续进行细胞免疫染色（D 部分）或将细胞 在 90% 甲醇中 -20°C 保存。

D. 免疫染色

注：使用血细胞计数器或备选方法计数细胞。

1. 通过离心以过量 1X PBS 洗涤分离，以去除甲醇。将上清液弃于合适的废液缸中。如有必要，可重复进行。
2. 将所需数目的细胞分装入试管或小孔中。（通常，每次分析 5x10⁵ 至 1x10⁶ 个细胞。）
3. 在 100 µl 稀释的一抗中重悬细胞，该一抗在 1X PBS 中按建议或如滴定测定所确定的稀释度配制。
4. 室温孵育 1 小时。避光。
5. 用 1X PBS 进行离心分离来洗涤。弃去上清液。重复。如果使用直接偶联抗体，则跳到步骤 9。
6. 在 100 µl 稀释的荧光物质偶联二抗中重悬细胞，该二抗在 1X PBS 中按建议或如滴定测定所确定的稀释度配制。
7. 室温孵育 30 分钟。
8. 用 1X PBS 进行离心分离来洗涤。弃去上清液。重复。
9. 在 200-500 µl 1X PBS 中重悬细胞，并在流式细胞分析仪上分析。