用于蛋白免疫印迹分析的免疫沉淀法
本实验步骤适用于天然蛋白质免疫沉淀法,进行蛋白质免疫印迹分析或激酶活动分析。
A. 溶液与试剂
注:用反渗透去离子 (RODI) 水或等效净化水制备溶液。
- 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS):(#9808)。
10X Cell Lysis Buffer: (#9803) 20 mM Tris (pH 7.5)、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM EGTA、1% Triton X-100、2.5 mM 焦磷酸钠、1 mM β-甘油磷酸酯、1 mM Na3VO4、1 µg/ml 亮抑酶肽
注:CST recommends adding 1 mM PMSF (#8553) before use*.
- 3X SDS 样品缓冲液: (#7722) 187.5 mM Tris-HCl(pH 值6.8 ,25°C 条件),6% w/v SDS,30% 甘油,150 mM DTT,0.03% w/v 溴酚蓝
- 10X 激酶缓冲液(激酶测定):(#9802) 要制备 1 ml 的 1X 激酶缓冲液,将 100 µl 10X 激酶缓冲液加入到 900 µl dH2O 中,并混匀。
- ATP (10 mM) (激酶测定):(#9804) 要制备 0.5 ml 的 ATP (200 µM),将 10 µl ATP (10 mM) 加入到 490 µl 1X 激酶缓冲液中。
B. 制备细胞裂解物
- 吸干培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
- 在非变性条件下收集细胞,去除培养基后用冰预冷的 PBS 洗涤细胞一次。
- 去除 PBS,每块平板 (10 cm) 添加 0.5 ml 冰冷的 1X 细胞裂解缓冲液,平板放在冰上孵育 5 分钟。
- 从板上刮下细胞,并且可将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
- 在冰上可对样品进行 3 次超声粉碎,每次 5秒。
- 在 4°C,14,000 x g 条件下,离心 10 分钟,将上清转移到新管中。如有必要,裂解物可保存在 –80°C。
C. 免疫沉淀法
- 取出200 μl 细胞裂解液,然后添加10 μl 的 固定抗体,并在4°C旋转孵育过夜。
- 4°C 条件下微量离心 30 秒。用 500 µl 的 1X 细胞裂解缓冲液,同时洗涤沉淀物五次。洗涤间期,保持样品于冰上。
- 继续使用蛋白质印迹法或激酶活性分析对进行样品分析(D 部分)。
D. 样品分析
继续下述其中一项的具体步骤。
用蛋白免疫印迹法进行分析
- 用 20 µl 3X SDS 样品缓冲液重悬沉淀物。涡旋振荡,然后在 14,000 x g 下瞬时离心 30 秒。
- 将样品加热至 95–100°C 并持续 2-5 分钟,然后在 14,000 x g 下微量离心 1 分钟。
- 对于 SDS-PAGE,将样品 (15–30 µl) 上样至 4–20% 凝胶上。
- 用蛋白质印迹法分析样品(请参阅蛋白质免疫印迹法实验步骤)。
注:When using primary antibodies produced in rabbit to detect proteins with a molecular weight in the range of 50 kDa, we recommend using Mouse Anti-Rabbit IgG (Light-Chain Specific) (D4W3E) mAb (#45262) or Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678) (or HRP conjugate #5127) as a secondary antibody to minimize interference produced by denatured rabbit heavy chain. 对于分子量大约为 25 kDa 的蛋白,建议使用 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678)(或 HRP conjugate #5127),以尽量减少变性小鼠重链或轻链产生的干扰。
当使用鼠源一抗检测分子量在 50 kDa 范围内的蛋白质时,我们建议使用 Rabbit Anti-Mouse IgG (Light Chain Specific) (D3V2A) mAb (HRP Conjugate) (#58802) 作为二抗,以尽量减少变性小鼠重链产生的干扰。
用激酶活性测定法进行分析
- 用 500 µl 1X 激酶缓冲液洗涤沉淀物两次。置于冰上。
- 在 40 µl 1X 激酶缓冲液中悬浮沉淀物,并补充 200 µM ATP 和适当的底物。
- 30°C 条件下孵育 30 分钟。
- 用 20 µl 3X SDS 样品缓冲液终止反应。涡旋振荡,然后再微量离心 30 秒。
- 将含有磷酸化底物的上清转移到另一管中。
- 将样品加热至 95–100°C 并持续 2-5 分钟,然后在 14,000 x g 下微量离心 1 分钟。
- 将样品上样 (15–30 µl) 到 SDS-PAGE (4–20%) 上。
发布时间 2007 年 12 月
修订时间 2021 年 10 月