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免疫荧光法（冷冻组织使用柠檬酸修复）

A. 溶液与试剂

注：利用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS)：( #9808) 要配制 1L 1 X PBS：添加 50 ml 20 X PBS 至 950 ml dH2O，然后将其混匀。调节 pH 至 8.0。
  2. 甲醛：16%, methanol free, Polysciences, Inc. (cat# 18814), use fresh and store opened vials at 4°C in dark, dilute in 1X PBS for use.
  3. 1X 柠檬酸盐修复液：To prepare 250 mL of 1X citrate unmasking solution, dilute 25 ml of SignalStain® Citrate Unmasking Solution (10X) (#14746) with 225 mL of dH2O.
  4. 封闭缓冲液：(1X PBS / 5% normal serum / 0.3% Triton™ X-100): (1X PBS / 5% normal serum / 0.3% Triton™ X-100): To prepare 10 ml, add 0.5 ml normal serum from the same species as the secondary antibody (e.g., Normal Goat Serum (#5425to 9.5 ml 1X PBS) and mix well. 搅拌的同时，加入 30 µl Triton™ X-100。
  5. 抗体稀释缓冲液：(1X PBS / 1% BSA / 0.3% Triton™ X-100): To prepare 10 ml, add 30 µl Triton™ X-100 to 10 ml 1X PBS. 充分混合后，添加 0.1 g BSA (#9998)，并混合。
  6. 建议的荧光染料标记的抗小鼠二抗：
  7. 注：首次使用一抗或荧光素标记二抗时，将抗体滴定至最佳稀释比例，使样品在最少的背景干扰下，获得最强的特异性信号。
  8. Prolong® Gold AntiFade Reagent (#9071)、Prolong® Gold AntiFade Reagent with DAPI (#8961)。

B. 样品制备和抗原修复

注：Application of traditional antigen retrieval procedures to fixed-frozen tissues may result in excessive liberation of sections from the slide. 高度建议用户使用提高组织粘附的试剂（如 HistoGrip™）预处理载玻片，同时将修复温度降至 70°C。

  1. 对于储存在 -80°C 下的组织：尝试制备切片前，从冰箱中取出来，并在 -20°C 下平衡约 15 分钟。这样可以防止切片在封闭时破裂。
  2. 将组织切成厚度在 6–20 µm 之间的切片，并将其置于带正电荷的载玻片上。
  3. 可选：在 60°C 下，在玻片加热器上烘烤 1 小时（这有助于切片黏附在玻片上）。
  4. 将玻片浸入 1X 柠檬酸修复液中，在微波炉中加热，并让温度维持在大约 70°C 20 分钟。
  5. 在实验台上冷却切片 30 分钟。
  6. 用 1X PBS 稍微漂洗切片。

免疫染色

注：所有随后的孵育都应当在室温下完成，除非另外注明需要在潮湿光密盒或带盖的培养皿/板中孵育，以防止干燥和荧光物质淬灭。

  1. 在封闭缓冲液中封闭标本 60 分钟。
  2. 封闭标本时，按照产品网页实验步骤中推荐的稀释比例，在抗体稀释缓冲液中配制一抗。
  3. 吸去封闭缓冲液，加入稀释后的一抗。
  4. 4°C 孵育过夜。
  5. 用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
  6. 在用抗体稀释缓冲液稀释的荧光染料标记二抗中，避光室温孵育样本 1-2 小时。
  7. 用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
  8. 用 Prolong® Gold Antifade Reagent (#9071) 或 Prolong® Gold Antifade Reagent with DAPI (#8961) ，给载玻片加盖玻片。
  9. 要达到最佳效果，使用封片液室温过夜。将切片平放避光 4°C 环境下，可长期保存。