蛋白质印迹法实验步骤

为了进行蛋白质印迹，在 4°C 将膜与 5% w/v BSA、1X TBS、0.1% Tween^® 20 中稀释的一抗孵育过夜，同时柔和振摇。

注：Please refer to primary antibody product webpage for recommended antibody dilution.

A. 溶液与试剂

注：利用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS)：( #9808) 为了制备 1 L 1 X PBS：添加 50 ml 20 X PBS 至 950 ml dH₂O，然后将其混匀。
2. 10X Tris 盐缓冲液 (TBS)：( #12498) 要制备 1 L 1X TBS：向 900 ml dH₂O 中添加 100 ml 10X，然后混匀。
3. 1X SDS 样品缓冲液：Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) ；通过添加 1/10 体积的 30 X DTT 至 1 体积的 3 X SDS 上样缓冲液，制备新鲜的 3 X 还原上样缓冲液。用 dH₂O 稀释至 1X。
4. 10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液：( #4050) 要制备 1 L 1X 电泳缓冲液：向 900 ml dH₂O 中添加 100 ml 10X 电泳缓冲液，然后混匀。
5. 10X Tris-Glycine 转移缓冲液：( #12539) 要制备 1 L 1X 转移缓冲液：向 200 ml 甲醇 + 700 ml dH₂O 中添加 100 ml 10X 转移缓冲液，然后混匀。
6. 10X Tris Buffered Saline with Tween^® 20 (TBST)：( #9997) 要制备 1 L 1X TBST：向 900 ml dH₂O 中添加 100 ml 10X TBST，然后混匀。
7. 脱脂奶粉：(#9999)。
8. 封闭缓冲液：含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST；要制备 150 ml，向 150 ml 1X TBST 中添加 7.5 g 脱脂奶粉并充分混匀。
9. 洗涤缓冲液：(#9997) 1X TBST。
10. 牛血清白蛋白 (BSA)：(#9998)。
11. 一抗稀释缓冲液：含 5% BSA 的 1X TBST；要制备 20 ml，请添加 1.0 g BSA 至 20 ml 1X TBST，然后混匀。
12. 生物素化的蛋白分子量标准品检测包：(#7727)。
13. Blue Prestained Protein Marker, Broad Range (11-250 kDa)：(#59329)。
14. 印迹膜和纸：(#12369) 本实验步骤已针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常推荐 0.2 µm 孔径。
15. HRP 偶联二抗：Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody (#7076).
16. 检测试剂：SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。

B. 蛋白质印迹

制备样品的常规流程。

1. 添加含有调节因子的新鲜培养基，使其对细胞进行处理一段时间。
2. 从培养物中吸出培养基；用 1X PBS 洗涤细胞；吸出。
3. 加入 1X SDS 样品缓冲液（6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径的平板 500 µl）来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
4. 超声处理 10–15 秒以完成细胞裂解并剪切 DNA（以降低样品粘度）。
5. 取 20 µl 样品，在 95–100°C 下加热 5 分钟；放在冰上冷却。
6. 微量离心机内离心 5 分钟。

7. 上样 20 µl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。

   注：建议将预染蛋白分子量标准品（#59329，10 µl/泳道）上样以验证电转移和将生物素化的蛋白质分子量标准品 (#7727，10 µl/泳道）上样以确定分子量。

8. 电转至硝酸纤维素膜 (#12369)。

C. 膜封闭和抗体孵育

注：容量适用于 10 cm x 10 cm (100 cm²) 的膜；对于不同尺寸的膜，请相应调整容量。

I. 膜封闭

1. （可选）转移之后，在室温下用 25 ml TBS 将硝酸纤维素膜洗涤 5 分钟。
2. 将膜置于 25 ml 封闭缓冲液中，在室温下孵育 1 小时。
3. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。

II. 一抗孵育

1. 将膜和一抗（按照产品网页中建议的适当稀释度和稀释液）置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。
2. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
3. 将膜与 Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody（#7076，按 1:2000 的比例）和 anti-biotin, HRP-linked Antibody（#7075，按 1:1000–1:3000 的比例）一起孵育并伴有轻轻摇晃，在室温下孵育 1 小时，再检测 10 ml 封闭缓冲液中的生物素化蛋白标记物。
4. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
5. 继续进行检测（D 部分）。

D. 蛋白质检测

使用说明：

1. 在 TBST 中清洗与膜结合的 HRP (Antibody Conjugate) 三次，持续 5 分钟。
2. 通过稀释一部分 2X 试剂 A 和一部分 2X 试剂 B（例如：要制备 10 ml，则添加 5 ml 试剂 A 和 5 ml 试剂 B），来制备 1X SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。混匀。
3. 将底物与膜一起孵育 1 分钟，倒掉多余溶液（膜将保持湿润），然后包裹在塑料中并在 X 线胶片下曝光。

* 避免反复接触皮肤。