流式细胞术、甲醇固定

A. 溶液与试剂

注：利用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

1. 1X 磷酸盐缓冲盐水（PBS）：配制 1 L 的 1X PBS：add 100 ml 10X PBS (#12528) to 900 ml water mix.
2. 100% 甲醇 (#13604)：Chill before use.
3. 抗体稀释缓冲液：Purchase ready-to-use Flow Cytometry Antibody Dilution Buffer (#13616), or prepare a 0.5% BSA PBS buffer by dissolving 0.5 g Bovine Serum Albumin (BSA) (#9998) in 100 ml 1X PBS. 4°C 保存。

注：在您的实验中加入荧光细胞染料（包括活性染料、DNA 染料等）时，请参考染料产品页，了解建议的实验步骤。访问 www.cellsignal.com，以了解经流式细胞术验证的细胞染料完整列表。

B. 固定

注：固定前，应分离贴壁细胞或组织，使它成为单细胞悬浮液。

注：理想的离心条件根据细胞类型和试剂容量有所不同。一般，1-5 分钟 150-300g 将足以使细胞沉淀下来。

注：如果使用全血，则需在固定前裂解红细胞并通过离心分离来洗涤。

注：Antibodies targeting CD markers or other extracellular proteins may be added prior to fixation if the epitope is disrupted by methanol. 在固定过程中，这类抗体保持结合目的靶标。但是，请注意，某些荧光团（包括PE和APC）会被甲醇损坏，因此在固定之前不应添加。如果您不确定，请进行小规模实验。

1. 通过离心使细胞沉淀下来，移除上清液。
2. 缓慢加入冰冷的 100％ 甲醇，同时轻轻涡旋固定细胞。加入足够量的甲醇以达到 90％ 的甲醇浓度（考虑到离心后残留的残留液体），如果需要，每 100 万个细胞中至少要加入 100 µl 甲醇，请添加甲醇。
3. 在 -15 °C 固定 20 分钟。此时甲醇也会使细胞透化，因此无需额外的透化步骤。
4. 继续进行免疫染色步骤。
   1. 或者，可将细胞储存在 -20°C 的甲醇中。

C. 免疫染色

注：使用血细胞计数器或备选方法计数细胞。

1. 通过离心以过量 1X PBS 洗涤分离，以去除甲醇。将上清液弃于合适的废液缸中。如有必要，可重复进行。
2. 将所需数目的细胞分装入试管或小孔中。（通常，每次分析 5x10⁵ 至 1x10⁶ 个细胞。）通过离心使细胞沉淀下来，移除上清液。
3. 在 100 µl 稀释的一抗中重悬细胞，这种一抗按建议的稀释度或如通过滴定所确定那样以抗体稀释缓冲液配制。充分混合以解离细胞沉淀。
4. 室温孵育 1 小时。
5. 在抗体稀释缓冲液或 1X PBS 中通过离心洗涤。弃去上清液。重复。如果使用直接偶联抗体，则跳到步骤 9。
6. 在 100 µl 稀释的荧光物质偶联的二抗（按建议稀释度用抗体稀释缓冲液制备）中重悬细胞。
7. 室温孵育 30 分钟。避光。
8. 在抗体稀释缓冲液或 1X PBS 中通过离心洗涤。弃去上清液。重复。
9. 在 200-500 µl 1X PBS 中重悬细胞，并在流式细胞分析仪上分析。