12957 Western Blotting Application Solutions Kit 实验步骤
注：请参阅一抗数据表或产品网页，以了解建议的一抗稀释缓冲液和建议的抗体稀释比例。
A. 溶液与试剂
注：利用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。
提供的试剂
- 10X 细胞裂解缓冲液：(#9803) To prepare 10 ml of 1X Cell Lysis Buffer: add 1 ml 10X Cell Lysis Buffer to 9 ml dH2O. 将缓冲液放在冰上预冷，并在使用前立即添加 50 µl 200X PMSF。
- 200X PMSF: (#8553) Reconstitute 34.84 mg of lyophilized PMSF in 1 ml isopropyl alcohol, to make a 200 mM solution.
- 1X SDS 样品缓冲液：Blue Loading Buffer Pack (#7722). 通过添加 1/10 体积的 30X DTT (#14265) 到 1 体积的 3X SDS 上样缓冲液 (#56036) 中，以制备新鲜的 3X 还原上样缓冲液。用 dH2O 稀释至 1X。
- Blue Prestained Protein Marker, Broad Range (11-250 kDa)：(#59329)。
- 10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液：( #4050) 要制备 1 L 1X 电泳缓冲液：add 100 ml 10X Running Buffer to 900 ml dH2O, mix.
- 10X Tris-Glycine 转移缓冲液：(#12539) To prepare 1 L 1X transfer buffer: 向 200 ml 甲醇 + 700 ml dH2O 中添加 100 ml 10X 转移缓冲液，然后混匀。
- Nitrocellulose Sandwiches: (#12369)。
- 10X Tris Buffered Saline with Tween® 20 (TBST): ( #9997) 要制备 1 L 1X TBST：向 900 ml dH2O 中添加 100 ml 10X TBST，然后混匀。
- 脱脂奶粉：(#9999)。
- 封闭缓冲液：含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST；要制备 150 ml，向 150 ml 1X TBST 中添加 7.5 g 脱脂奶粉并充分混匀。
- 洗涤缓冲液：1X TBST。
- 牛血清白蛋白 (BSA)：(#9998)。
- 一抗稀释缓冲液：如一抗数据表上所示，含 5% BSA 或 5% 脱脂奶粉的 1X TBST；要制备 20 ml，向 20 ml 1X TBST 中添加 1.0 g BSA 或脱脂奶粉并充分混匀。
- HRP 偶联二抗：Anti-rabbit (#7074); anti-mouse (#7076).
- 检测试剂：SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。试剂 A (#46935) 和 B (#74709) 应该在使用前合并。
其他试剂（未提供）
- 一抗。
- 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS)：( #9808) 为了制备 1 L 1 X PBS：添加 50 ml 20 X PBS 至 950 ml dH2O，然后将其混匀。
- 反渗透去离子（RODI）水。
- 异丙醇。
- BCA Protein Assay Kit: (#7780) (OPTIONAL).
- 生物素化的蛋白分子量标准品检测包：(#7727) (OPTIONAL).
- 甲醇。
- 10X Tris 盐缓冲液 (TBS)：( #12498) 要制备 1 L 1X TBS：add 100 ml 10X to 900 ml dH2O, mix. （可选）。
- Streptavidin-HRP: (#3999) (if necessary).
B. 蛋白质印迹
制备样品的常规流程。
- 添加含有调节因子的新鲜培养基，使其对细胞进行处理一段时间。
- 从培养物中吸出培养基；用 1X PBS 洗涤细胞；吸出。如果进行蛋白质浓度定量，请继续执行步骤 #3，否则，请跳至步骤 #8。
- 加入 1X 细胞裂解缓冲液（6 孔板每孔 80 µl 或 10 cm 直径的反应板 400 µl）来裂解细胞。在冰上孵育反应板 5 分钟，然后从反应板上刮下细胞，然后将裂解液转移到微量离心管中。置于冰上。
- 超声处理 10–15 秒以完成细胞裂解并剪切 DNA（以降低样品粘度）。置于冰上。
- 提取物用冷微量离心机以 14,000 x g 速率分离 10 分钟。将上清液转移到新管中并丢弃沉淀物。
- 使用 BCA Protein Assay Kit #7780 测定蛋白浓度。
- 加入 3X SDS 样品缓冲液至终浓度 1X。继续进行步骤 #10。
- 加入 1X SDS 样品缓冲液（6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径的反应板 500 µl）来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
- 超声处理 10–15 秒以完成细胞裂解并剪切 DNA（以降低样品粘度）。置于冰上。
- 取 20 µl 样品，在 95–100°C 下加热 5 分钟；放在冰上冷却。
- 微量离心机内离心 5 分钟。
- 使用 1X 电泳缓冲液来制备电泳凝胶和仪器。
- 上样 15 µl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。
注：建议将预染蛋白分子量标准品（#59329，5 µl/泳道）上样以验证电转移和将生物素化的蛋白质分子量标准品 (#81851，10 µl/泳道）上样以确定分子量。
- 在水箱（湿式）转膜系统中使用 1X 转膜缓冲液用电转至硝酸纤维素膜（#12369）。
C. 膜封闭和抗体孵育
注：Volumes are for 10 cm x 10 cm (100 cm2) or smaller membrane; for larger membranes, adjust volumes accordingly.
I. 膜封闭
- （可选）转移之后，在室温下用 25 ml TBS 将硝酸纤维素膜洗涤 5 分钟。
- 将膜置于 25 ml 封闭缓冲液中，在室温下孵育 1 小时。
- 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
II. 一抗孵育
根据所使用的一抗，继续下述其中一项的具体步骤。
对于无偶联的一抗
- 将膜和一抗（按照产品说明书中建议的适当稀释度和稀释液）置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。
- 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
- 按一抗来源选取合适的 HRP 偶联的二抗（#7074 或 #7076，按 1:2000），而且在必要时加入 anti-biotin, HRP-linked Antibody（#7075 ，按 1: 1000-1:3000）以检测生物素化的蛋白质标准品，置于 10 ml 封闭缓冲液中在室温下孵育 1 小时并不时轻轻搅动。
- 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
- 继续进行检测（D 部分）。
对于偶联有HRP 的一抗
- 将膜和一抗（按照产品数据表中建议的适当稀释度）置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。
- 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
- 如有必要，与检测生物素酰化蛋白质标准品的 Anti-biotin, HRP-linked Antibody （#7075 ，按 1: 1000-1:3000）在室温下于 10 ml 封闭缓冲液中一起孵育 1 小时并不时轻轻搅动。
- 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
- 继续进行检测（D 部分）。
对于生物素化的一抗
- 将膜和一抗（按照产品数据表中建议的适当稀释度）置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。
- 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
- 在10 ml 封闭缓冲液中使用 1:2000 Streptavidin-HRP（#3999，未提供）孵育膜，在室温条件下轻轻摇动 1 小时。
- 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
- 继续进行检测（D 部分）。
请勿加入用于检测生物素化蛋白标准品的 Anti-biotin, HRP-linked Antibody。没有必要。Streptavidin-HRP 也将会使生物素化标准品可视化。