免疫荧光法（冷冻组织使用柠檬酸修复）

A. 溶液与试剂

注：利用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS)：( #9808) 要配制 1L 1 X PBS：添加 50 ml 20X PBS 到 950 ml dH2O 中，混合均匀。调节 pH 至 8.0。
2. 甲醛：16%, methanol free, Polysciences, Inc. (cat# 18814), use fresh and store opened vials at 4°C in dark, dilute in 1X PBS for use.
3. 1X 柠檬酸盐修复液：要制备 250 ml 的 1X 柠檬酸盐修复液，将 25 ml 的 SignalStain^® Citrate Unmasking Solution (10X) (#14746) 用 225 ml 的 dH₂O 进行稀释。
4. 封闭缓冲液：(1X PBS / 5% normal serum / 0.3% Triton^™ X-100): 准备 10 ml 缓冲液，添加 0.5 ml 与二抗同一物种来源的正常血清（例如加入 Normal Goat Serum (#5425) 到 9.5 ml 1X PBS 中）并混匀。搅拌的同时，添加 30 µl Triton^™ X-100。
5. 抗体稀释缓冲液：(1X PBS / 1% BSA / 0.3% Triton^™ X-100): To prepare 10 ml, add 30 µl Triton^™ X-100 to 10 ml 1X PBS. 充分混合后，添加 0.1 g BSA (#9998)，并混合。
6. 建议的荧光染料标记的抗小鼠二抗：
   • Anti-Rabbit IgG (H+L)，F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 488 Conjugate) #4412
   • Anti-Rabbit IgG (H+L)，F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 555 Conjugate) #4413
   • Anti-Rabbit IgG (H+L)，F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 594 Conjugate) #8889
   • Anti-Rabbit IgG (H+L)，F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 647 Conjugate) #4414
7. 注：首次使用一抗或荧光素标记二抗时，将抗体滴定至最佳稀释比例，使样品在最少的背景干扰下，获得最强的特异性信号。
8. Prolong^® Gold AntiFade Reagent (#9071)，Prolong^® Gold AntiFade Reagent with DAPI (#8961)。

B. 样品制备和抗原修复

注：Application of traditional antigen retrieval procedures to fixed-frozen tissues may result in excessive liberation of sections from the slide. 强烈建议用户使用可提高组织粘性的试剂（如 HistoGrip^™）来预处理玻片，同时将修复温度降至 70°C。

1. 对于储存在 -80°C 下的组织：尝试制备切片前，从冰箱中取出来，并在 -20°C 下平衡约 15 分钟。这样可以防止切片在封闭时破裂。
2. 将组织切成厚度在 6–20 µm 之间的切片，并将其置于带正电荷的载玻片上。
3. 在 60°C 下，在玻片加热器上烘烤 1 小时（这有助于切片黏附在玻片上）。
4. 将玻片浸入 1X 柠檬酸修复液中，在微波炉中加热，并让温度维持在大约 70°C 20 分钟。
5. 在实验台上冷却切片 30 分钟。
6. 用 1X PBS 稍微漂洗切片。

免疫染色

注：所有随后的孵育都应当在室温下完成，除非另外注明需要在潮湿光密盒或带盖的培养皿/板中孵育，以防止干燥和荧光物质淬灭。

1. 在封闭缓冲液中封闭标本 60 分钟。
2. 封闭标本时，按照产品网页实验步骤中推荐的稀释比例，在抗体稀释缓冲液中配制一抗。
3. 吸去封闭缓冲液，加入稀释后的一抗。
4. 4°C 孵育过夜。
5. 用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
6. 在用抗体稀释缓冲液稀释的荧光染料标记二抗中，避光室温孵育样本 1-2 小时。
7. 用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
8. 使用 Prolong^® Gold Antifade Reagent (#9071) 或 Prolong^® Gold Antifade Reagent with DAPI (#8961) ，用盖玻片盖住切片。
9. 要达到最佳效果，使用封片液室温过夜。将切片平放避光 4°C 环境下，可长期保存。