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免疫荧光法(冰冻)

A. 溶液与试剂

:利用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS): (9808) To prepare 1L 1X PBS: 添加 50 ml 20 X PBS 至 950 ml dH2O,然后将其混匀。调节 pH 至 8.0。
  2. 甲醛:16%, methanol free, Polysciences, Inc. (cat# 18814), use fresh and store opened vials at 4°C in dark, dilute in 1X PBS for use.
  3. 封闭缓冲液:(1X PBS / 5% normal serum / 0.3% Triton™ X-100): 准备 10 ml 缓冲液,添加 0.5 ml 与二抗同一物种来源的正常血清(例如加入 Normal Goat Serum (#5425) 到 9.5 ml 1X PBS 中)并混匀。搅拌时加入 30 µl Triton™ X-100。
  4. 抗体稀释缓冲液:(1X PBS / 1% BSA / 0.3% Triton™ X-100): 准备 10 ml 溶液,添加 30 µl Triton™ X-100 到 10 ml 1X PBS 中。充分混合后,添加 0.1 g BSA (#9998),并混合。
  5. 建议使用荧光物质标记的 Anti-Mouse 二抗:

  6. Prolong® Gold AntiFade Reagent (#9071),Prolong® Gold AntiFade Reagent with DAPI (#8961)。

B. 样品制备 - 冰冻/恒冷箱切片 (IF-F)

  1. 冰冻固定组织进行免疫染色(C 部分)。
  2. 对新鲜未固定的冰冻组织,请立刻按下列步骤固定:
    1. 切片用 1X PBS 中稀释的 4% 甲醛浸没。

      :甲醛有毒性,仅限在通风橱中使用。

    2. 室温下固定切片 15 分钟。
    3. 吸干液体后用 1X PBS 冲洗三次,每次 5 分钟。
    4. 继续进行免疫染色操作(C 部分)。

C. 免疫染色

:所有随后的孵育都应当在室温下完成,除非另外注明需要在潮湿光密盒或带盖的培养皿/板中孵育,以防止干燥和荧光物质淬灭。

  1. 在封闭缓冲液中封闭标本 60 分钟。
  2. 封闭标本时,按照产品网页实验步骤中推荐的稀释比例,在抗体稀释缓冲液中配制一抗。
  3. 吸去封闭缓冲液,加入稀释后的一抗。
  4. 4°C 孵育过夜。
  5. 用 1X PBS 漂洗三次,每次 5 分钟。
  6. 用抗体稀释缓冲液将荧光物质标记的二抗稀释后,室温下避光孵育标本 1–2 小时。
  7. 用 1X PBS 漂洗三次,每次 5 分钟。
  8. 使用 Prolong® Gold Antifade Reagent (#9071) 或 Prolong® Gold Antifade Reagent with DAPI (#8961) ,用盖玻片盖住切片。
  9. 要达到最佳效果,使用封片液室温过夜。将切片平放避光 4°C 环境下,可长期保存。

发布​时间 2006 年 11 月

修订时间 2016 年 7 月