免疫荧光法（免疫细胞化学）

A. 溶液与试剂

注：用反渗透去离子 (RODI) 水或等效净化水制备溶液。

1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS)： (9808) To prepare 1L 1X PBS: 添加 50 ml 20 X PBS 至 950 ml dH₂O，然后将其混匀。调节 pH 至 8.0。
2. 甲醛：16%, methanol free, Polysciences, Inc. (cat# 18814), use fresh and store opened vials at 4°C in dark, dilute in 1X PBS for use.
3. Blocking Buffer (1X PBS / 5% normal serum): To prepare 10 ml, add 0.5 ml 20X PBS, 1.25 ml normal serum from the same species as the secondary antibody (e.g., Normal Goat Serum (#5425)) and 9.0 mL dH₂O and mix well.
4. 抗体稀释缓冲液 (1X PBS / 1% BSA)：Add 0.1 g BSA (9998) to 10 ml 1X PBS and mix well.

5. 建议使用荧光物质标记的 Anti-Mouse 二抗：

   • Anti-Mouse IgG (H+L)，F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 488 Conjugate)#4408
   • Anti-Mouse IgG (H+L)，F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 555 Conjugate)#4409
   • Anti-Mouse IgG (H+L)，F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 594 Conjugate)#8890
   • Anti-Mouse IgG (H+L)，F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 647 Conjugate)#4410

   注：首次使用一抗或荧光素标记二抗时，将抗体滴定至最佳稀释比例，使样品在最少的背景干扰下，获得最强的特异性信号。

6. Prolong^® Gold AntiFade Reagent (#9071)，Prolong^® Gold AntiFade Reagent with DAPI (#8961)。

B. 标本制备 - 培养细胞系 (IF-IC)

注：细胞应当在多孔板、腔室玻片或盖玻片上直接培养、处理、固定和染色。

1. 吸干液体，随后在细胞上覆盖一层 2–3 mm 用 1X PBS 稀释的 4% 甲醛。
   注：甲醛有毒性，仅限在通风橱中使用。
2. 室温下固定细胞 15 分钟。
3. 吸去固定液，用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
4. 继续进行免疫染色操作（C 部分）。

C. 免疫染色

注：所有随后的孵育都应当在室温下完成，除非另外注明需要在潮湿光密盒或带盖的培养皿/板中孵育，以防止干燥和荧光物质淬灭。

1. 在封闭缓冲液中封闭标本 60 分钟。
2. 封闭时，按产品网页中列出的抗体稀释缓冲液中稀释来制备一抗。
3. 吸去封闭缓冲液，加入稀释后的一抗。
4. 4°C 温度下孵育过夜。
5. 用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
6. 用抗体稀释缓冲液将偶联荧光素的二抗稀释后，室温下避光孵育标本 1–2 小时。
7. 按步骤 5 使用 1X PBS 漂洗。
8. 使用 Prolong^® Gold Antifade Reagent (#9071) 以及带 DAPI (#8961) 的 Prolong^® Gold AntiFade Reagent 盖住切片。
9. 为达到最佳效果，应立即采用适当的激发波长检测标本。将切片平放避光 4°C 环境下，可长期保存。