兔抗体的流式细胞术 Triton™ X-100 透化实验步骤

A. 溶液与试剂

本实验步骤中所需的所有试剂均可与我公司的 Intracellular Flow Cytometry Kit (Triton™ X-100) #51995 一并高效购买，或使用下文所列的货号单独购买。

注：利用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

1. 1X 磷酸盐缓冲盐水（PBS）：配制 1 L 的 1X PBS：添加 100 ml 10X PBS (#12528) 至 900 ml 水，然后将其混合。
2. 4% 甲醛，无甲醇 (#47746)
3. 细胞通透缓冲液：购买即用型 (#39487) 或者通过添加 30 µl Triton™ X-100 至 10 ml 抗体稀释缓冲液来制备10 ml。4°C 保存。
4. 抗体稀释缓冲液：Purchase ready-to-use Flow Cytometry Antibody Dilution Buffer (#13616), or to prepare 100 ml dissolve 0.5 g Bovine Serum Albumin (BSA) (#9998) in 100 ml 1X PBS. 4°C 保存。
5. 建议使用 Anti-Rabbit 二抗：
   • Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab′)₂ Fragment (Alexa^® 488 Conjugate) #4412
   • Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab′)₂ Fragment (Alexa^® 594 Conjugate) #8889
   • Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab′)₂ Fragment (Alexa^® 647 Conjugate) #4414
   • Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab′)₂ Fragment (PE Conjugate) #79408

注：在您的实验中加入荧光细胞染料（包括活性染料、DNA 染料等）时，请参考染料产品页，了解建议的实验步骤。访问 www.cellsignal.com，了解经验证用于流式细胞术的细胞染料完整列表。

B. 固定与透化

注：固定前，应分离贴壁细胞或组织，使它成为单细胞悬浮液。

注：理想的离心条件根据细胞类型和试剂容量有所不同。一般，1-5 分钟 150-300g 将足以使细胞沉淀下来。

注：如果使用全血，则需在固定前裂解红细胞并通过离心分离来洗涤。

注：如果表位被甲醛和/或 Triton™ X-100 破坏，可以在固定前添加靶向 CD 标记物或其他胞外蛋白的抗体。在固定和透化过程期间，这类抗体将保持与目的靶标结合。如果您不确定，请进行小规模实验。

1. 通过离心使细胞沉淀下来，移除上清液。
2. 按每 100 万个细胞大约 100 µl 4% 甲醛重悬细胞。混匀以解离沉淀物并防止各个细胞交联。
3. 室温 (20-25°C) 固定 15 分钟。
4. 通过离心用过量 1X PBS 洗涤。将上清液弃于合适的废液缸中。
5. 在每一百万个细胞约 100 μl 细胞透化缓冲液中重悬细胞。
6. 在室温孵育 10 分钟。
7. 继续进行染色或将细胞在 PBS 中 -4°C 保存过夜。

C. 免疫染色

注：使用血细胞计数器或备选方法计数细胞。

1. 将所需数目的细胞分装入试管或小孔中。（通常，每次检测用 5x10⁵ 至 1x10⁶ 个细胞）。
2. 将细胞离心，弃去清液。
3. 在 100 µl 稀释的一抗中重悬细胞，这种一抗按建议的稀释度或如通过滴定所确定那样以抗体稀释缓冲液配制。
4. 室温 (20-25°C) 孵育 1 小时。
5. 在抗体稀释缓冲液或 1X PBS 中通过离心洗涤。弃去上清液。重复。
6. 在 100 µl 稀释的荧光素偶联的二抗（按建议的稀释比例用抗体稀释缓冲液制备）中重悬细胞。
7. 在室温 (20-25°C) 下孵育 30 分钟。避光。
8. 在抗体稀释缓冲液或 1X PBS 中通过离心洗涤。弃去上清液。重复。
9. 在 1X PBS 中重悬细胞，在流式细胞分析仪上分析。