天然蛋白质免疫沉淀法

本实验步骤适用于使用 Protein G agarose beads 对天然蛋白进行免疫沉淀，以便之后进行蛋白质免疫印迹或激酶活性分析。

A. 溶液与试剂

注：利用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS)：(#9808) 要制备 1 L 的 1X PBS，将50 ml 20X PBS 加入到 950 ml dH₂O 中，并混匀。

2. 10X 细胞裂解缓冲液：(#9803) To prepare 10 ml of 1X cell lysis buffer, add 1 ml cell lysis buffer to 9 ml dH₂O, mix.

   注：使用前，立刻加入 1 mM PMSF (#8553)。

3. 3X SDS 样品缓冲液：Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) ；通过添加 1/10 体积的 30 X DTT 至 1 体积的 3 X SDS 上样缓冲液，制备新鲜的 3 X 还原上样缓冲液。
4. Protein G Agarose Beads: (#37478)。
5. 10X 激酶缓冲液（激酶测定）：(#9802) To Prepare 1 ml of 1X kinase buffer, add 100 μl 10X kinase buffer to 900 μl dH₂O, mix.
6. ATP (10 mM) （激酶测定）：(#9804) To prepare 0.5 ml of ATP (200 μM), add 10 μl ATP (10 mM) to 490 μl 1X kinase buffer.

B. 制备细胞裂解物

1. 吸干培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基，使其对细胞进行处理一段时间。
2. 在非变性条件下收集细胞，去除培养基后用冰预冷的 1X PBS 洗涤细胞一次。
3. 去除 PBS，每块平板 (10 cm) 添加 0.5 ml 冰冷的 1X 细胞裂解缓冲液，平板放在冰上孵育 5 分钟。
4. 从板上刮下细胞，把提取物转移至微量离心管。置于冰上。
5. 在冰上进行 3 次超声破碎，每次 5 秒。
6. 在 4°C，在 14,000 x g 条件下，微量离心 10 分钟，将上清转移到新管中。上清液即为细胞裂解物。如有必要，裂解物可保存在 –80°C。

C. 免疫沉淀法

细胞裂解物预澄清（可选）

1. 涡旋振荡，以混合磁珠。
2. 将 10–30 μl 的 50% Protein G agarose bead 混悬液添加到 200 μl 浓度为 1 mg/ml 的细胞裂解物中。
3. 在 4°C 下，旋转孵育 30–60 分钟。
4. 4°C 条件下微量离心 10 分钟。将上清转移到新管中。
5. 继续以下的免疫沉淀法。

免疫沉淀法

重要事项：强烈建议使用相应的同型对照，以便在你的一抗免疫沉淀中显示特异性结合。把 Normal Rabbit IgG #2729 用于多克隆一抗，把 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP^® Isotype Control #3900 用于兔单克隆一抗，把 Mouse (G3A1) mAb IgG1 Isotype Control #5415 用于小鼠 IgG1 单克隆一抗，把 Mouse (E5Y6Q) mAb IgG2a Isotype Control #61656 用于小鼠 IgG2a 单克隆一抗，把 Mouse (E7Q5L) mAb IgG2b Isotype Control #53484 用于小鼠 IgG2b 单克隆一抗，Mouse (E1D5H) mAb IgG3 Isotype Control #37988 用于小鼠 IgG3 单克隆一抗。同型对照的浓度应匹配，并与一抗样品同时进行。

1. 将一抗（按产品数据表中的建议进行适当稀释）添加到 200 μl 浓度为 1 mg/ml 的细胞裂解物中。在 4°C 下，旋转孵育过夜。
2. 添加 Protein G agarose（10–30 μl 的 50% 混悬液）。在 4°C 下，旋转孵育 1-3 小时。
3. 4°C 条件下微量离心 30 秒。用 500 µl 的 1X 细胞裂解缓冲液，同时洗涤沉淀物五次。洗涤间期，保持样品于冰上。
4. 继续使用蛋白免疫印迹法或激酶活性检测对样品进行分析（D 部分）。

D. 样品分析

继续下述其中一项的具体步骤。

用蛋白免疫印迹法进行分析

1. 使用 20 μl 3X SDS 样品缓冲液使沉淀物重新悬浮。涡旋振荡，然后在 14,000 x g 下瞬时离心 30 秒。
2. 将样品加热至 95–100°C 并持续 2-5 分钟，然后在 14,000 x g 下微量离心 1 分钟。
3. 在 SDS-PAGE 的 4–20% 的凝胶上加载样品 (15–30 μl)。
4. 用蛋白质印迹法分析样品（请参阅蛋白质免疫印迹法实验步骤）。

注：When using primary antibodies produced in rabbit to to detect proteins with a molecular weight in the range of 50 kDa, we recommend using Mouse Anti-Rabbit IgG (Light-Chain Specific) (D4W3E) mAb (#45262) or Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678) (or HRP conjugate #5127) as a secondary antibody to minimize interference produced by denatured rabbit heavy chain. 对于分子量大约为 25 kDa 的蛋白，建议使用 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678)（或 HRP conjugate #5127），以尽量减少变性小鼠重链或轻链产生的干扰。

当使用鼠源一抗检测分子量在 50 kDa 范围内的蛋白质时，我们建议使用 Rabbit Anti-Mouse IgG (Light Chain Specific) (D3V2A) mAb (HRP Conjugate) (#58802) 作为二抗，以尽量减少变性小鼠重链产生的干扰。

用激酶活性测定法进行分析

1. 使用 500 μl 1X 激酶缓冲液洗涤沉淀物两次。置于冰上。
2. 使沉淀物悬浮在添加 40 μM ATP 和适当底物的 200μl 1X 激酶缓冲液中。
3. 30°C 条件下孵育 30 分钟。
4. 使用 20 μl 3X SDS 样品缓冲液终止反应。涡旋振荡，然后再微量离心 30 秒。
5. 将含有磷酸化底物的上清转移到另一管中。
6. 将样品加热至 95–100°C 并持续 2-5 分钟，然后在 14,000 x g 下微量离心 1 分钟。
7. 在 SDS-PAGE (4–20%) 上加载样品 (15–30 μl)。