天然蛋白质免疫沉淀法

本实验步骤适用于使用蛋白 G 磁性分离法对天然蛋白进行免疫沉淀，以进行蛋白质免疫印迹或激酶活性分析。

A. 溶液与试剂

注：利用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS)：(#9808) 要制备 1 L 的 1X PBS，将50 ml 20X PBS 加入到 950 ml dH₂O 中，并混匀。

2. 10X 细胞裂解缓冲液：(#9803) To prepare 10 ml of 1X cell lysis buffer, add 1 ml cell lysis buffer to 9 ml dH₂O, mix.

   注：使用前，立刻加入 1 mM PMSF (#8553)。

3. 3X SDS 样品缓冲液：Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) ；通过添加 1/10 体积的 30 X DTT 至 1 体积的 3 X SDS 上样缓冲液，制备新鲜的 3 X 还原上样缓冲液。
4. Protein G Magnetic Beads: (#70024)。
5. 磁分离架：(#7017) or (#14654).
6. 10X 激酶缓冲液（激酶测定）：(#9802) 要制备 1 ml 的 1X 激酶缓冲液，将 100 µl 10X 激酶缓冲液加入到 900 µl dH₂O 中，并混匀。
7. ATP (10 mM) （激酶测定）：(#9804) 要制备 0.5 ml 的 ATP (200 µM)，将 10 µl ATP (10 mM) 加入到 490 µl 1X 激酶缓冲液中。

B. 制备细胞裂解物

1. 吸干培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基，使其对细胞进行处理一段时间。
2. 在非变性条件下收集细胞，去除培养基后用冰预冷的 1X PBS 洗涤细胞一次。
3. 去除 PBS，每块平板 (10 cm) 添加 0.5 ml 冰冷的 1X 细胞裂解缓冲液，平板放在冰上孵育 5 分钟。
4. 从板上刮下细胞，把提取物转移至微量离心管。置于冰上。
5. 在冰上进行 3 次超声破碎，每次 5 秒。
6. 在 4°C，在 14,000 x g 条件下，微量离心 10 分钟，将上清转移到新管中。上清液即为细胞裂解物。如有必要，裂解物可保存在 –80°C。

C. 免疫沉淀法

细胞裂解物预澄清（强烈建议）

强烈建议进行细胞裂解物预清除步骤，以减少结合 Protein G Magnetic beads 的非特异性蛋白。为检测样品和同型对照预澄清足够裂解物。

1. 稍微涡旋母液试管，以重悬磁珠。

重要事项：Pre-wash #70024 magnetic beads just prior to use:

2. 转移 20 μl 珠浆到一根干净的试管中。将试管放在磁分离架上 10-15 秒钟。

   一旦溶液变澄清，便小心清除缓冲液。添加 500 μl 1X 细胞裂解缓冲液到磁珠沉淀物中，稍微涡旋以洗涤珠子。将试管放回磁分离架。一旦溶液变澄清，便清除缓冲液。再次进行洗涤步骤。

3. 添加 200 μl 细胞裂解物到 20 μl 预先洗涤的磁珠中。

   重要事项：最佳裂解物浓度将取决于目的蛋白的表达水平。建议起始浓度为 250 μg/ml-1.0 mg/ml。

4. 在室温下旋转孵育 20 分钟。
5. 使用一个磁分离架将珠子与裂解物分离，并将预澄清的裂解物转移到一根干净的试管中，随后去除磁珠沉淀物。
6. 继续进行免疫沉淀部分。

免疫沉淀法

重要事项：强烈建议使用相应的同型对照，以便在你的一抗免疫沉淀中显示特异性结合。把 Normal Rabbit IgG #2729 用于多克隆一抗，把 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP^® Isotype Control #3900 用于兔单克隆一抗，把 Mouse (G3A1) mAb IgG1 Isotype Control #5415 用于小鼠 IgG1 单克隆一抗，把 Mouse (E5Y6Q) mAb IgG2a Isotype Control #61656 用于小鼠 IgG2a 单克隆一抗，把 Mouse (E7Q5L) mAb IgG2b Isotype Control #53484 用于小鼠 IgG2b 单克隆一抗，Mouse (E1D5H) mAb IgG3 Isotype Control #37988 用于小鼠 IgG3 单克隆一抗。同型对照的浓度应匹配，并与一抗样品同时进行。

1. 将一抗（按产品数据表中建议的合适稀释比例）添加到 200 µl 细胞裂解物中。在 4°C 下旋转孵育过夜，从而形成免疫复合物。
2. 预先洗涤磁珠（参见细胞裂解物预澄清部分，步骤 1 和 2）。
3. 将裂解物和抗体（免疫复合物）溶液转移到一根含有已洗涤磁珠沉淀物的试管中。
4. 室温下振摇孵育 20 分钟。
5. 使用磁性分离架将磁珠沉淀小球。用 500 µl 的 1X 细胞裂解缓冲液，洗涤沉淀物五次。洗涤间期，保持样品于冰上。
6. 继续使用免疫印迹法或激酶活动进行分析（D 部分）。

D. 样品分析

继续下述其中一项的具体步骤。

用蛋白免疫印迹法进行分析

1. 在 20-40 µl 3X SDS 样品缓冲液中重悬沉淀物，稍微涡旋以混匀，随后稍微微量离心分离来让样品沉淀。
2. 将样品加热到 95–100°C，并持续 5 分钟。
3. 使用磁性分离架将磁珠沉淀小球。将上清液转移到新试管。上清液为样品。
4. 将样品上样 (15-30 µl) 至 SDS-PAGE上。
5. 用蛋白质印迹法分析样品（请参阅蛋白质免疫印迹法实验步骤）。

注：When using primary antibodies produced in rabbit to detect proteins with a molecular weight in the range of 50 kDa, we recommend using Mouse Anti-Rabbit IgG (Light-Chain Specific) (D4W3E) mAb (#45262) or Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678) (or HRP conjugate #5127) as a secondary antibody to minimize interference produced by denatured rabbit heavy chain. 对于分子量大约为 25 kDa 的蛋白，建议使用 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678)（或 HRP conjugate #5127），以尽量减少变性小鼠重链或轻链产生的干扰。

当使用鼠源一抗检测分子量在 50 kDa 范围内的蛋白质时，我们建议使用 Rabbit Anti-Mouse IgG (Light Chain Specific) (D3V2A) mAb (HRP Conjugate) (#58802) 作为二抗，以尽量减少变性小鼠重链产生的干扰。

用激酶活性测定法进行分析

1. 用 500 µl 1X 激酶缓冲液洗涤沉淀物两次。置于冰上。
2. 在 40 µl 1X 激酶缓冲液中悬浮沉淀物，并补充 200 µM ATP 和适当的底物。
3. 30°C 条件下孵育 30 分钟。
4. 用 20 µl 3X SDS 样品缓冲液终止反应。涡旋振荡，然后再微量离心 30 秒。
5. 将含有磷酸化底物的上清转移到另一管中。
6. 将样品加热至 95–100°C 并持续 2-5 分钟，然后在 14,000 x g 下瞬时离心 1 分钟。
7. 将样品 (15-30 µl) 上样到 SDS-PAGE 凝胶上。