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XP® 单克隆抗体的出色敏感性

虽然特异性是一种优质抗体的最重要标准，但在研究样品有限或蛋白呈低内源水平表达时，敏感性变得很重要。我们使用蛋白质印迹分析来比较 Phospho-GSK-3β (Ser9) (D85E12) XP® Rabbit mAb #5558、Phospho-S6 Ribosomal Protein (Ser235/236) (D57.2.2E) XP® Rabbit mAb #4858 和竞争公司的产品。我们还比较了 #4858 与 Cell Signaling Technology 的其他兔单克隆抗体 #4856 和 #4857。

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  • 蛋白质印迹分析（结果图 1）表明了 #5558 的出众特异性和敏感性。
  • 对于 #5558，所应用的抗体浓度显著较低，这进一步说明了产品的敏感性。
  CST #5558 竞争公司 1 竞争公司 2
蛋白质印迹法稀释度 1:1000 1:200 1:500、1:250
检测浓度 (µg/mL) 0.29 0.5 1
建议的应用 W, IP, IF-IC, F W, IP W, IF-IC, F
物种交叉反应性 H, M, R, Hm H, M H
对 CST 的 #5558 与竞争对手的产品进行蛋白质印迹分析

结果图 1. Jurkat 细胞（左图）用 PI3 激酶抑制剂 LY294002 #9901（可抑制 GSK-3β 磷酸化）或 Calyculin A #9902（会通过抑制细胞提取物中的磷酸酶来人工提高磷酸化水平）处理。对于所有抗体，用于检测经 calyculin A 处理的样品时，在相应分子量 (46 kDa) 处检测到信号，但使用 #5558 时信号最强。注：竞争公司 2 的产品还显示出大量的非特异性条带，其强度高于相应的 46 kDa 条带。Jurkat 细胞（右图）不作处理或用凋亡诱导试剂依托泊苷处理，这是一种已知会降低 GSK-3β 磷酸化的处理。在未经处理或已经依托泊苷处理的样品中，竞争公司的产品均不能检测磷酸化 GSK-3β。

  • 蛋白质印迹分析（结果图 2）表明，与竞争产品相比，#4858 能检测更低浓度的蛋白。
  • #4858 的特异性和敏感性水平均较高，因此该抗体在各种研究应用中显示出出色性能。
  CST #4858 竞争公司 1
蛋白质印迹法稀释度 1:2000 1:1000
检测浓度 (µg/mL) 0.029 未知
建议的应用 W, IHC-P, IHC-F, IF-IC, F W
物种交叉反应性 H, M, R, Mk, Sc, (C) H, (R)

对 CST 的 #4858 与竞争对手的产品进行蛋白质印迹分析

结果图 2. 对于未经处理或已经胰岛素处理的 NIH/3T3 细胞（100 nM，10 分钟）的提取物，使用梯度稀释的 #4858（稀释度为 1:2000）进行检测，对于竞争公司的抗体，使用制造商建议的范围内的最低稀释度 (1:1000)。使用 #4858 观察到的信号更强，而在最少数量的提取物泳道或未处理的提取物泳道（包含基础水平的磷酸化 S6），几乎不可见竞争公司抗体的信号。注：竞争公司的抗体显示出交叉反应性条带，条带信号强于相应分子量的条带，这表明这种产品缺乏特异性。

Phospho-S6 Ribosomal Protein (Ser235/236) (D57.2.2E) XP® Rabbit mAb #4858 与 Rabbit Monoclonals #4856 和 #4857 的比较

  • 如结果图 3A 和 3B 所示，所有三种 CST 抗体均显示出一条相应分子量的特异性条带，这符合 CST 的高标准验证要求以及对高质量的承诺。
  • 与 #4856 或 #4857 相比，#4858 的销售母液能检测更低浓度的裂解物（结果图 3B）。
  • 对石蜡包埋的结肠癌细胞进行 IHC后，所进行的平行分析表明使用匹配的抗体浓度时信号更强，显示在 IHC 中，#4858 也比 #4857 更为敏感（结果图 4）。
  • 在以匹配的浓度进行共聚焦免疫荧光分析时，#4858 似乎能产生稍微更亮的信号（结果图 5A）。
  • 在高含量平台上，以梯度稀释对免疫荧光强度进行的定量表明，#4858 较 #4856 的强度更大（结果图 5B）。
  • 在使用流式细胞术进行的平行比较中，使用最佳浓度时，#4858 的荧光强度和诱导作用较对照强。此外，#4858 的建议最佳检测浓度低于 #4856（结果图 6）。

使用 XP® #4858 及非 XP® #4856 和 #4857 进行蛋白质印迹分析来比较

结果图 3A. 使用梯度稀释的抗体 #4858 和 #4856（从 1 μg/ml 开始）对经胰岛素处理的 HeLa 细胞的提取物进行蛋白质印迹分析。两种抗体都会产生干净的特异性信号。但观察到 #4858 能产生更强的信号。在所示的 5 秒曝光图上，#4858 在浓度为 1 ng/ml 时能产生强信号，而 #4856 产生的信号则弱得多。

结果图 3B. 对经胰岛素处理的 HeLa 细胞（100 nM，10 分钟）的梯度稀释提取物进行蛋白质印迹分析，使用CST 出售的 #4858、#4856 和 #4857（稀释比例为 1:1000）母液进行检测。使用 #4858 时再一次观察到最强信号。

对石蜡包埋的结肠癌细胞进行免疫组织化学分析。

结果图 4. 使用浓度匹配 (80 ng/ml) 的 #4858 和 #4857 对石蜡包埋的结肠癌细胞进行免疫组织化学分析。虽然两种抗体都会产生特定信号，但使用 #4858 时观察到的信号强度显著更强。

对 C6 细胞、LY294002 和 U0126 进行共聚焦免疫荧光分析。

结果图 5A. 使用 #4858（左图）或 #4856（右图）对经 LY294002 #9901、U0126 #9903 和雷帕霉素处理 2 小时（上图）或经胰岛素（100 nM，30 分钟；下图）处理的 C6 细胞进行共聚焦免疫荧光分析。肌动蛋白纤丝用 Alexa Fluor® 555 phalloidin（红色）标记。蓝色伪彩 = DRAQ5 #4084（DNA 荧光染料）。使用最佳浓度 (0.25 μg/ml) 时，#4858 似乎能产生更强的信号。如需了解数值，请参见结果图 5B。

结果图 5B. 比较 #4858 和 #4856 的平行免疫荧光滴定分析。两种抗体的最佳浓度测定为 0.25 μg/ml。使用这个浓度时，#4858 产生的信号亮度要高出 2 倍，表明敏感性更高。

平行免疫荧光滴定分析。 对 Jurkat 细胞进行流式细胞滴定分析

结果图 6A. 使用最佳浓度（分别为 0.25 和 0.5 μg/ml）的 #4858（左图）和 #4856（右图），对未经处理（灰色填充）或已经 LY294002 #9901、wortmannin #9951 和 U0126 #9903（无填充）处理的 Jurkat 细胞进行流式细胞分析。

结果图 6B. 比较 #4858 和 #4856 的平行免疫荧光滴定分析。#4858 和 #4856 的最佳浓度分别测定为 0.25 和 0.5 μg/ml。使用这些浓度时，#4858 产生的信号亮度几乎要高出 2 倍。此外，倍性诱导几乎是对照的 2 倍（未显示）。这些结果表明，进行流式细胞术时，#4858 的敏感性更高。

对 Jurkat 细胞进行流式细胞分析。