注：为取得最佳结果，Cell Signaling Technology (CST) 强烈建议使用我们为每个产品提供的针对具体应用的优化后方案。这些方案是 CST 进行了大量内部验证的结果，并且能够确保得到精确和可重复的结果。
使用荧光标记二抗的蛋白质印迹法检测可实现更准确的定量，以及使用不同物种一抗的双色多路技术。磷酸化和总蛋白水平可在同一个膜上确定，不同分子量的不同靶标的调节也可同时进行检测。但要谨记的是，一抗的亲和力是有区别的，任何两个单独的抗体都不可直接互相比较，而是必须要进行标准化。在某些情况下，荧光检测可能不如化学发光检测敏感，因此可能不适合表达水平较低的蛋白质。荧光免疫印迹检测需要专业仪器，如荧光成像器。
对 COS 细胞提取物进行蛋白质印迹法分析，细胞为未处理的或经 U0126 (#9903)（10 µM，持续 1 小时）或 TPA (#4174)（200 nM，持续 10 分钟）处理的细胞，使用 Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (D13.14.4E) XP® Rabbit mAb (#4370) 和 p44/42 MAPK (Erk1/2) (3A7) Mouse mAb (#9107)检测。
对 Raw264.7 细胞提取物进行蛋白质印迹法分析，细胞为未经处理的或经 LPS 处理的细胞（1 µg/ml，持续 6 小时），使用 iNOS Antibody (#2977)检测。
CST 提供用于荧光蛋白质印迹法的改良免疫印迹法实验步骤。我们发现封闭步骤期间不添加 Tween-20 为唯一且必要的重要改变。全部细节可以在我们的荧光蛋白质免疫印迹实验步骤（一抗在 BSA 中孵育）和我们的荧光蛋白质免疫印迹实验步骤（一抗在乳中孵育）中找到。此外，我们的 Prestained Protein Marker, Broad Range (Premixed Format) #7720 在近红外波长下有自发荧光。
双色蛋白质印迹法需要不同物种的一抗和偶联有不同染料的相应二抗。如果一抗需要使用不同的一抗孵育缓冲液，则每一种一抗都应在两种缓冲液中单独测试，以确定双标实验的最佳缓冲液。由于抗原表位重叠、一抗和/或二抗引起的干扰、或一抗孵育缓冲液的不兼容，一些抗体对可能不能协同工作。