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SimpleChIP® Plus 染色质免疫沉淀法实验步骤（琼脂糖微珠）

染色质免疫沉淀法

产品专有： SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Agarose Beads) #9004。

所需的试剂

包括的试剂：

  1. Glycine Solution (10X) #7005
  2. Buffer A (4X) #7006
  3. Buffer B (4X) #7007
  4. ChIP Buffer (10X) #7008
  5. ChIP Elution Buffer (2X) #7009
  6. 5 M NaCl #7010
  7. 0.5 M EDTA #7011
  8. ChIP-Grade Protein G Agarose Beads（用 BSA 和经超声处理的鲑精 DNA 进行封闭）#9007
  9. DNA Binding Buffer #10007
  10. DNA Wash Buffer（使用前添加 4x 体积乙醇）#10008
  11. DNA Elution Buffer #10009
  12. DNA 纯化柱和收集管 #10010
  13. Protease Inhibitor Cocktail (200X) #7012
  14. RNAse A (10 mg/ml) #7013
  15. Micrococcal Nuclease #10011
  16. Proteinase K (20 mg/ml) #10012
  17. SimpleChIP® Human RPL30 Exon 3 Primers 1 #7014
  18. SimpleChIP® Mouse RPL30 Intron 2 Primers 1 #7015
  19. Histone H3 (D2B12) XP® Rabbit mAb (ChIP Formulated) #4620
  20. Normal Rabbit IgG #2729
  21. DTT (Dithiothreitol) #7016

未包括的试剂：

  1. 1X PBS #9872
  2. Nuclease Free Wate #12931
  3. 乙醇 (96-100%)
  4. 甲醛（37% 母液）
  5. SimpleChIP® Universal qPCR Master Mix #88989
! 这就表示在实验流程中基于免疫沉淀制备物（IP 制备物）数量的容积改变是重要的一步。一份 IP 制备物是指 4 x 106 个组织培养细胞或 25 mg 离体的组织。
!! 这就表示，进行操作前稀释缓冲液是重要的一步。
安全停止 如果需要停止，这是实验步骤中的一个安全停止点。

I. 组织交联和样品制备

当收获组织时，去除样品上不需要的材料，如脂肪和坏死组织。随后可以立即处理并交联组织，或在干冰上冷冻并储存于 -80°C 以待稍后处理。为获得最佳的染色质产率和 ChIP 结果，每次进行免疫沉淀法测试时，使用 25 mg 的组织。不同组织类型的染色质产率也不尽相同，并且一些组织在每次免疫沉淀法测试需要超过 25 mg。有关不同组织类型的预期染色质产率的更多信息，请参见附录 A。额外需要一份染色质样品进行染色质消化和浓度分析（第四部分）。如果需要，应处理额外五份染色质样品，以最优化染色质消化（附录 B）。

在开始之前：

(!) 所有缓冲液的用量都应按照实验中 IP 制备物的数量成比例的增加。

  • 取出并预热 200X Protease Inhibitor Cocktail (PIC) #7012 和 10X Glycine Solution #7005。确保 PIC 完全解冻。
  • 对每 25 mg 待处理组织，制备 3 ml 磷酸盐缓冲液 (PBS) + 15μl 200X PIC 并置于冰上。
  • 对于每 25 mg 待处理组织，制备 45μl 37% 甲醛并置于室温下贮存。使用在制造商标示的有效期内的新鲜甲醛。

A. 交联

  1. 称重新鲜或冷冻的组织样品。每次免疫沉淀法使用 25 mg 组织进行实验（一次实验至少需要 75 mg 组织以包含阳性和阴性对照）。
  2. 将组织样品置于 60 mm 或 100 mm 培养皿中并用干净的解剖刀或剃须刀片切碎。将培养皿放在冰上。重要的是将组织置于低温下以防止蛋白质降解。
  3. 将切碎的组织转移至 15 ml 锥形试管。
  4. 对于每 25 mg 组织，添加 1 ml PBS+ PIC 到锥形试管。
  5. 为了使蛋白质与 DNA 交联，向每 1 ml PBS + PIC 中添加 45μl 37% 甲醛并在室温下振摇 20 分钟。甲醛最终浓度是 1.5%。
  6. 向每 1 ml PBS + PIC 中添加 100 μl 10X 甘氨酸以终止交联并在室温下混合 5 分钟。
  7. 将组织置于台式离心机中，在 4℃ 下以 500 x g 的速度离心 5 分钟。
  8. 移除上清液并用 1 ml PBS+ PIC/25 mg 组织洗涤一次。
  9. 将组织置于台式离心机中，在 4℃ 下以 500 x g 的速度重复离心 5 分钟。
  10. 移除上清液，对于每 25 mg 组织，将组织重悬于 1 ml PBS + PIC 中并置于冰上贮存。使用 Medimachine（B 部分）或 Dounce 匀浆器（C 部分），将组织分离成单细胞悬液。（安全停止）或者，样本裂解前在 -80°C 条件下最多可保存 3 个月。

B. 使用 BD Biosciences 的 Medimachine（部件号 340587）离散组织

  1. 切去 1000 μL 移液器吸头的末端以扩大开口，用以转移组织块。
  2. 将 1 ml 重悬于 PBS + PIC 中的组织转移到 50 mm Medicone（部件号 340592）的顶部室。
  3. 根据制造商的说明，研磨组织 2 分钟。
  4. 使用 1 ml 注射器和 18 号钝头针，从 Medicone 的底部室收集细胞悬液。将细胞悬液转移至 15 ml 锥形试管并置于冰上。
  5. 重复步骤 2 至 4，直到全部组织均处理成均匀悬液。
  6. 如果需要更充分地碾磨，则向组织中添加更多的 PBS + PIC。重复步骤 2 至 5，直到全部组织均研磨成均匀悬液。
  7. 用显微镜检查单细胞悬液（可选）。
  8. 将组织置于台式离心机中，在 4℃ 下以 2,000 x g 的速度离心 5 分钟。
  9. 从细胞移除上清液，紧接着进行胞核制备和染色质消化（第三部分）。

C. 使用 Dounce 匀浆器离散组织

  1. 将重悬于 PBS + PIC 中的组织转移至 Dounce 匀浆器。
  2. 敲击 20-25 次离散组织小片。用显微镜检查单细胞悬液（可选）。
  3. 将细胞悬液转移至 15 ml 锥形试管并置于台式离心机中在 4℃ 下以 2,000 x g 离心 5 分钟。
  4. 从细胞移除上清液，紧接着进行胞核制备和染色质消化（第三部分）。

II. 细胞培养物交联和样品制备：

为达到最佳染色质免疫沉淀法结果，每次免疫沉淀法使用大约 4 X 106 细胞进行实验（至少需要 12 X 106 个细胞以包含阳性和阴性对照）。对于 Hela 细胞，一次免疫沉淀相当于 15 cm 培养皿所含细胞（在 20 ml 生长培养基中的融合度为 90%）的一半。要进行染色质消化和浓度分析，应当处理一份额外样品（第四部分）。因为每种细胞类型都不相同，我们推荐您在实验中准备一盘额外的细胞，通过使用血球仪或细胞计数器确定细胞的数量。

在开始之前：

(!) 所有缓冲液体积应根据使用的 15 cm 组织培养皿（或 20 ml 悬浮细胞）数量按比例增加。

  • 取出并预热 200X Protease Inhibitor Cocktail (PIC) #7012 和 10X Glycine Solution #7005。确保 PIC 完全解冻。
  • 对于每个待处理的 15 cm 培养皿（或 20 ml 悬浮细胞），配制 2 ml 磷酸盐缓冲液 (PBS) + 10 μl 200X PIC，并放在冰上。
  • 对于每个待处理的 15 cm 培养皿（或 20 ml 悬浮细胞），配制 40 ml PBS，并放在冰上。
  • 对于每个待处理的 15 cm 细胞培养皿（或 20 ml 悬浮细胞），配制 540 μl 37% 甲醛，并保存在室温下。使用在制造商标示的有效期内的新鲜甲醛。
  1. 为让蛋白与 DNA 交联，每个含有 20 ml 培养基的 15 cm 培养皿添加 540 μl 37% 甲醛。对于悬浮细胞，添加 540 µl 37% 甲醛到在 20 ml 培养基中悬浮的细胞中（如要对悬浮细胞进行最佳固定，固定时的细胞密度应少于 0.5 x 106 个细胞/ml）。短暂旋转混匀并置于室温下孵育 10 分钟。甲醛的最终浓度是 1%。添加甲醛可能导致培养基颜色发生变化。
  2. 每个含 20 ml 培养基的 15 cm 培养皿添加 2 ml 10X 甘氨酸，稍微涡旋混合，并在室温下孵育 5 分钟。添加甘氨酸可能导致培养基颜色发生变化。
  3. 对于悬浮细胞，将细胞转移至 50 ml 锥形试管，置于台式离心机中在 4℃ 下以 500 x g 离心 5 分钟，并用 20 ml 冰冷的 PBS 洗涤沉淀物两次。移除上清液，紧接着进行胞核制备和染色质消化（第三部分）。
  4. 对于贴壁细胞，移除培养基和用 20 ml 冰冷的 1X PBS 洗涤细胞两次，每次都要从培养皿完全移除洗液。
  5. 每个 15 cm 培养皿添加 2 ml 冰冷的 PBS + PIC。将细胞刮入冷的缓冲液中。将所有培养皿的细胞混合放入一个 15 ml 锥形试管。
  6. 将细胞置于台式离心机中，在 4℃ 下以 2,000 x g 的速度离心 5 分钟。从细胞移除上清液，紧接着进行胞核制备和染色质消化（第 三 部分）。（安全停止）或者，样本在 -80°C 条件下最多可保存 3 个月。

III. 胞核制备和染色质消化

在开始之前：

(!) 所有缓冲液的用量都应按照实验中 IP 制备物的数量成比例的增加。

  • 取出并预热 200X Protease Inhibitor Cocktail (PIC) #7012。使用前确保它完全融化。
  • 配制 1 M DTT (192.8 mg DTT #7016 + 1.12 ml dH2O)。确保 DTT 晶体完全溶解。

    (!!) 重要事项：一旦配制在溶液中，将 1 M DTT 置于 -20℃ 下存放。

  • 取出并加热 10X ChIP Buffer #7008 并确保 SDS 完全溶解。
  • 对于每份 IP 制备物，制备 1 ml 1X 缓冲液 A（250 μl 4X Buffer A #7006 + 750 μl 水） + 0.5 μl 1M DTT + 5 μl 200X PIC 并置于冰上。
  • 对于每份 IP 制备物，制备 1.1 ml 1X 缓冲液 B（275 μl 4X Buffer B #7007 + 825 μl 水） + 0.55 μl 1M DTT 并置于冰上。
  • 对于每份 IP 制备物，制备 100 μl 1X ChIP 缓冲液（10 μl 10X ChIP Buffer #7008 + 90 μl 水）+ 0.5 μl 200X PIC 并置于冰上。
  1. 对于每份 IP 制备物，将细胞重悬于 1 ml 冰冷的 1X 缓冲液 A + DTT + PIC 中。在冰上孵育 10 分钟。每 3 分钟颠倒试管混匀。
  2. 将细胞置于台式离心机中，在 4℃ 下以 2,000 x g 的速度离心 5 分钟从而沉淀胞核。对于每份 IP 制备物，移除上清液并将沉淀物重悬于 1 ml 冰冷的 1X 缓冲液 B + DTT 中。对于每份 IP 制备物，重复离心，移除上清液并将沉淀物重悬于 100 μl 1X 缓冲液 B + DTT。将样品转移至 1.5 ml 微量离心管，直至每支试管共装有 1 ml 样品。
  3. 向每份 IP 制备物中添加 0.5 μl Micrococcal Nuclease #10011，通过翻转离心管数次进行混合并且在 37℃ 下孵育 20 分钟，同时频繁搅拌，以使 DNA 消化成大约 150-900 bp 的长度。每 3 至 5 分钟翻转进行混合。对于各种组织和细胞系（参见附录 B），可能需要通过预实验确定将 DNA 消化成最佳长度所需 Micrococcal Nuclease 的量。用 0.5 μl Micrococcal Nuclease/4 x 106 个 Hela 细胞消化的胞核和用 0.5 μl Micrococcal Nuclease/25 mg 组织消化的小鼠肝组织产生了适当长度的 DNA 片段。
  4. 向每份 IP 制备物中添加 10 μl 0.5 M EDTA #7011 并将离心管置于冰上 1-2 分钟以终止消化。
  5. 置于微量离心机中，在 4℃ 下以 16,000 x g 离心 1 分钟，使胞核沉淀，并移除上清液。
  6. 对于每份 IP 制备物，将胞核沉淀物重悬于 100 μl 1X ChIP 缓冲液 + PIC 中并在冰上孵育 10 分钟。
  7. 对于每支 1.5 ml 微量离心管，用几个脉冲对至多 500 μl 裂解物进行声波处理，以破坏胞核膜。脉冲间隔将样品置于湿冰上孵育 30 秒。可以通过在光学显微镜下观察声波处理前后的胞核，确定完全裂解胞核所需的最佳条件。通过使用设置为 6 且配有 1/8 英寸探头的 VirTis Virsonic 100 Ultrasonic Homogenizer/Sonicator，Hela 胞核在 3 组 20 秒脉冲之后完全裂解。或者，可以通过将裂解物置于 Dounce 匀浆器中搅匀 20 次，裂解胞核；但是，裂解可能不完全。
  8. 在 4°C 下用微量离心机以 9,400 x g 的离心力离心分离 10 分钟来使裂解物变澄清。
  9. 将上清液转移至新试管。（安全停止） 这是交联的染色质制备物，应当置于 -80 ℃ 下贮存直至进一步使用。取出 50 μl 染色质制备物进行染色质消化和浓度分析（第四部分）。这份 50 µl 的样本可以在 -20°C 下过夜保存。

IV. 染色质消化和浓度分析（建议的步骤）

  1. 向 50 μl 染色质样品（在第三部分的步骤 9 中制备）中添加 100 μl 无核酸酶水、6 μl 5M NaCl #7010 和 2 μl RNAse A #7013。涡旋混合，并在 37℃ 下孵育样品 30 分钟。
  2. 向每份经 RNAse A 消化的样品添加 2 μl Proteinase K #10012。涡旋混合，并在 65℃ 下孵育样品 2 小时。
  3. 按第七部分中所述的步骤，使用 DNA 纯化离心柱从样品中纯化 DNA。（安全停止）DNA 样本在 -20°C 条件下最多可保存 6 个月。
  4. 在纯化 DNA 后，取出 10 μl 样品并将其与 100 bp DNA 标准品置于 1% 琼脂糖凝胶上进行电泳以确定 DNA 片段的大小。应当将 DNA 消化成大约 150-900 bp 的长度（1 至 5 个核小体）。
  5. 要确定 DNA 浓度，将 2μl 纯化的 DNA 转移到 98 μl 无核酸酶水 中，以获得 50 倍稀释度并读取 OD260。DNA 浓度（以 μg/ml 计）为 OD260 x 2,500。最理想的 DNA 浓度应介于 50 和 200 µg/ml 之间。

注：为了获得最佳的 ChIP 结果，适宜大小和浓度的染色质非常关键。染色质过度消化可能会在 PCR 定量时削弱信号。染色质消化不充分可能导致背景信号增加和分辨率降低。向 IP 中添加染色质过少可能导致在 PCR 定量时信号削弱。优化染色质消化的实验步骤可以在附录 B 中找到。

V. 染色质免疫沉淀法

为了获得最佳的 ChIP 结果，每次免疫沉淀使用大约 5 至 10 μg 消化的交联染色质（如第四部分中所测定）。这应当和来自 25 mg 分散的组织或 4 x 106 个组织培养细胞的单一 100μl IP 制备物大致相等。在添加抗体之前，通常将 100μl 消化的染色质稀释到 400μl 1X ChIP 缓冲液中。但是，如果每次 IP 需要 100 μl 以上的染色质，则交联的染色质制备物不需要按照下述方法进行稀释。可以直接向未稀释的染色质制备物中添加抗体以对染色质复合体进行免疫沉淀测试。

在开始之前：

(!) 所有缓冲液的用量都应按照实验中免疫沉淀物的数量成比例的增加。

  • 取出并预热 200X Protease Inhibitor Cocktail (PIC) #7012。确保 PIC 完全解冻。
  • 取出并加热 10X ChIP Buffer #7008 并确保 SDS 完全溶解。
  • 融化消化的染色质制备物（在第三部分的步骤 9 中制备）并置于冰上。
  • 制备低盐洗液：每次免疫沉淀使用 3 ml 1X ChIP 缓冲液（300 μl 10X ChIP Buffer #7008 + 2.7 ml 水）。在室温下储存直至使用。
  • 制备高盐洗液：每次免疫沉淀使用 1 ml 1X ChIP 缓冲液（100 μl 10X ChIP Buffer #7008 + 900 μl 水）+ 70 μl 5M NaCl #7010。在室温下储存直至使用。

注：ChIP-Grade Protein G Agarose Beads 使用超声处理的鲑精 DNA 封闭，故不可用于 ChIP-Seq 实验。

  1. 在一支试管中，制备足够的 1X ChIP 缓冲液以稀释消化的染色质到进行免疫沉淀所需的数量：每次免疫沉淀使用 400 μl 1X ChIP 缓冲液（40 μl 10X ChIP 缓冲液 + 360 μl 水）+ 2 μl 200X PIC。当确定免疫沉淀次数时，记得纳入阳性对照样品 Histone H3 (D2B12) XP® Rabbit mAb #4620 和阴性对照样品 Normal Rabbit IgG Antibody #2729。将混合物置于冰上。
  2. 对于每次免疫沉淀，向配置的 1X ChIP 缓冲液中添加 100 μl（5 至 10 μg 染色质）等量的消化的交联染色质制备物（在第三部分中的步骤 9 中制备）。例如，要进行 10 次免疫沉淀，需要准备一支含有 4 ml 1X ChIP 缓冲液（400 μl 10X ChIP 缓冲液 + 3.6 ml 水）+ 20 μl 200X PIC + 1 ml 消化的染色质制备物的试管。
  3. 取出 10 μl 稀释的染色质样品并将其转移至微量离心管。这将作为 2% 样品输入对照，该样品在后续使用之前可以置于 -20℃ 下贮存（第六部分的步骤 1 ）。
  4. 对于每次免疫沉淀，将 500 μl 稀释的染色质转移至 1.5 ml 微量离心管并添加免疫沉淀抗体。每次 IP 需要的抗体量不定而且应当由使用者确定。对于阳性对照 Histone H3 (D2B12) XP® Rabbit mAb #4620，向 IP 样品中添加 10 μl。对于阴性对照 Normal Rabbit IgG #2729，向 IP 样品中添加 1μl (1 μg) 至 2 μl (2 μg)。如果使用 Cell Signaling Technology 的抗体，请参考数据手册或产品网页上列出的推荐稀释比例，并根据 Cell Signaling 抗体浓度计算 IgG 抗体的量 (µg) 作为阴性对照，这样才能公正的比较。将 IP 样品在 4℃ 下转动孵育 4 小时至过夜。

    注：对于大部分 Cell Signaling Technology 抗体，添加 1 和 2 ug 到每份 IP 样品中效果最佳。当存在多份不同浓度的样品时，最好使阴性对照 Normal Rabbit IgG #2729 与最高抗体浓度相匹配。

  5. 轻轻摇晃进行混合，使 ChIP-Grade Protein G Agarose Beads #9007 重悬。每次免疫沉淀反应立即添加 30 μl ChIP-Grade Protein G Agarose Beads 并在 4°C 下振荡孵育 2 小时。
  6. 每次免疫沉淀法中在微量离心机中以 3,400 x g 离心大约 1 分钟，使 Protein G Agarose Beads 沉淀，然后取出上清液。
  7. 通过向微珠中添加 1 ml 低盐洗液洗涤 ChIP-Grade Protein G Agarose Beads，并在 4℃ 下转动孵育 5 分钟。再重复步骤 6 和 7 两次，以确保总共进行 3 次低盐洗涤。
  8. 向微珠中添加 1 ml 高盐洗液并且在 4℃ 下转动孵育 5 分钟。
  9. 每次免疫沉淀法中在微量离心机中以 3,400 x g 离心大约 1 分钟，使 Protein G Agarose Beads 沉淀，然后取出上清液。立即进入第六部分。

VI. 将染色质从抗体/Protein G Agarose Beads 洗脱并解交联

在开始之前：

(!) 所有缓冲液的用量都应按照实验中免疫沉淀物的数量成比例的增加。

  • 取出 2X ChIP Elution Buffer #7009 并置于 37℃ 水浴中加热，并确保 SDS 溶解。
  • 将水浴或热混合仪设为 65℃。
  • 对于每次免疫沉淀和 2% 样品输入对照，制备 150μl 1X ChIP 洗脱缓冲液（75 μl 2X ChIP Elution Buffer #7009 + 75 μl 水）。
  1. 向 2% 样品输入对照管中添加 150 μl 1X ChIP 洗脱缓冲液并置于室温下直至开始进行步骤 6。
  2. 向每份 IP 样品中添加 150 μl 1X ChIP 洗脱缓冲液。
  3. 在 65℃ 下将染色质从抗体/Protein G Agarose Beads 洗脱 30 分钟，同时轻轻涡旋混合（1,200 转/分钟）。对于这个步骤，热混合仪效果最佳。或者，可以在室温下转动洗脱，但是可能不会完全洗脱。
  4. 每次免疫沉淀法中在微量离心机中以 3,400 x g 离心大约 1 分钟，使 Protein G Agarose Beads 沉淀，然后取出上清液。
  5. 小心地将洗脱下来的染色质上清液转移至新试管。
  6. 向所有试管（包括步骤 1 中的 2% 输入样品）中添加 6 μl 5M NaCl 和 2 μl Proteinase K #10012 解交联，并在 65 °C 下孵育 2 小时。这次孵育可以延长过夜。
  7. 立即进入第七部分。(安全停止) 或者，样本在 -20°C 条件下最多可保存 4 天。然而，为了避免形成沉淀物，确保在添加 DNA Binding Buffer #10007 之前，将样品加热到室温（第七部分，步骤 1）。

VII. 使用离心柱纯化 DNA：

在开始之前：

  • (!!) 使用前向 DNA Wash Buffer #10008 中添加 24 ml 乙醇 (96-100%)。此操作仅需在第一次DNA纯化前进行。
  • 对于第五部分制备的每份 DNA 样品，取出一支 DNA 纯化收集管 #10010。
  1. 向每份 DNA 样品中添加 750 μl DNA Binding Buffer #10007 并短暂涡旋混合。
    • 对于每 1 体积样品，应当使用 5 倍体积的 DNA 结合缓冲液。
  2. 从在步骤 1 中制备的每份样品中取出 450 μl 并将其至收集管的 DNA 离心柱中。
  3. 用离心机以 18,500 x g 离心 30 秒。
  4. 从收集管取出离心柱并丢弃液体。离心柱再放入收集管中。
  5. 从在步骤 1 中制备的每份样品中取出剩余的 450 μl 并将其转移至收集管的离心柱中。重复步骤 3 和 4。
  6. 向收集管的离心柱中添加 750 μl DNA Wash Buffer #10008。
  7. 用离心机以 18,500 x g 离心 30 秒。
  8. 从收集管取出离心柱并丢弃液体。离心柱再放入收集管中。
  9. 用离心机以 18,500 x g 离心 30 秒。
  10. 丢弃收集管和液体。保留离心柱。
  11. 向每个离心柱中添加 50 μl DNA Elution Buffer #10009 并将其置于洁净的 1.5 ml 微量离心管中。
  12. 用微量离心机以 18,500 x g 的离心力离心分离 30 秒，以洗脱 DNA。
  13. 取出并丢弃 DNA 离心柱。洗脱物即纯化的 DNA。（安全停止） 样本可以在 -20°C 条件下保存。

VIII. 通过 PCR 定量 DNA：

建议：

  • 使用带滤嘴的移液器吸头，从而最大限度地减少污染风险。
  • 试剂盒中所含的对照引物专门用于人或小鼠 RPL30 基因（#7014 + #7015）并且可以用于标准 PCR 或实时荧光定量 PCR。如果使用者进行的是另一个物种的 ChIP，则建议使用者针对 DNA 设计适宜的特异性引物并确定最佳的 PCR 条件。
  • 建议使用热启动 Taq 聚合酶以最大限度降低非特异性 PCR 产物的风险。
  • PCR 引物选择至关重要。应当严格遵循以下标准设计引物：
引物长度： 24 个核苷酸
最佳 Tm： 60℃
最佳 GC： 50%
扩增子尺寸： 150 至 200 bp（标准 PCR）
  80 至 160 bp（实时荧光定量 PCR）

标准 PCR 方法：

  1. 根据待分析样品的数量，标记适宜数量的 0.2 ml PCR 管。这些样品应当包括 2% 样品输入对照、阳性对照组蛋白 H3 样品、阴性对照 Normal Rabbit IgG 样品，和未加入 DNA 的试管以排除 DNA 污染。
  2. 向每支管中添加 2 μl 相应的 DNA 样品。
  3. 按下文所述的步骤制备主反应混合物，配置时多配置两个样本的试剂以弥补分管时的体积损耗。向每支反应管中添加 18 μl 主混合物。
试剂 1 次 PCR 反应所需体积 (18 μl)
无核酸酶的 H2O 12.5 μl
10X PCR 缓冲液 2.0 μl
4mM dNTP 混合物 1.0 μl
5 μM RPL30 引物 2.0 μl
Taq DNA 聚合酶 0.5 μl
  1. 启动以下 PCR 反应程序
a. 初始变性 95℃ 5 分钟
b. 变性 95℃ 30 秒
c. 复性 62℃ 30 秒
d. 延伸 72℃ 30 秒
e. 重复步骤 b-d，共循环 34 次。
f. 终末延伸 72℃ 5 分钟
  1. 从每支反应管中取出 10 μl PCR 产物，使其与 100 bp DNA 标准品同时进行 2% 琼脂糖凝胶或 10% 聚丙烯酰胺凝胶电泳，以进行分析。人 RPL30 #7014 和小鼠 RPL30 #7015 的 PCR 产物预期大小分别是 161 bp 和159 bp。

实时荧光定量 PCR 方法：

  1. 标记适当数量、兼容待用 PCR 仪型号的 PCR 管或 PCR 平板。PCR 反应应当包括阳性对照组蛋白 H3 样品、阴性对照 Normal Rabbit IgG 样品、监控 DNA 污染的不含 DNA 模板的试管和 2% 输入对照组染色质 DNA 的连续稀释物（未稀释、1:5、1:25、1:125），以生成标准曲线并测定扩增效率。
  2. 向 PCR 平板上的每只管或每个孔中添加 2 μl 相应的 DNA 样品。
  3. 按下文所述的步骤制备主反应混合物。额外足量配置两个反应的试剂以弥补分管时的体积损失。向每支 PCR 反应管或每个孔中添加 18 μl 反应混合物。（安全停止）如有必要用铝箔纸盖住平板以避光，并在 4°C 下最多保存 4 小时或在 -20°C 下过夜，直到机器可以使用。
试剂 1 次 PCR 反应所需体积 (18 μl)
无核酸酶的 H2O 6 μl
5 μM RPL30 引物 2 μl
SimpleChIP® Universal qPCR Master Mix #88989 10 μl
  1. 启动以下 PCR 反应程序：
a. 初始变性 95℃ 3 分钟
b. 变性 95℃ 15 秒
c. 复性和延伸： 60℃ 60 秒
d. 重复步骤 b 和 c，共循环 40 次。
  1. 使用实时 PCR 仪的自带软件，分析定量 PCR 结果。或者，可以使用input样品百分数方法和以下所示的公式，手动计算 IP 效率。采用这种方法，从每次免疫沉淀获得的信号表述为占总input样品染色质的百分比。

输入百分比 = 2% x 2（C[T] 2% 输入样品 – C[T] IP 样品）

C[T] = CT = PCR 反应的阈周期

附录 A：预期的染色质产率

从组织样品收获交联的染色质时，组织类型之间的染色质产率可能显著不同。右表显示了用 25 mg 组织（类似于 4 x 106 个 Hela 细胞）制备的染色质预期产率和预期 DNA 浓度的范围，该产率和浓度按实验步骤第四部分的方法测定。对于每种组织类型，使用 Medimachine (BD Biosciences) 或 Dounce 匀浆器离散获得了相似数量的染色质。但是，与用通过 Dounce 匀浆器离散的组织制备和处理的染色质相比，用通过 Medimachine 离散的组织制备和处理的染色质通常具有更高的 IP 效率。强烈推荐 Dounce 匀浆器用于离散脑组织，原因是 Medimachine 无法将脑组织充分分离成单细胞悬液。为了获得最佳的 ChIP 结果，我们建议每次免疫沉淀使用 5 至 10 μg 消化的交联染色质，因此，对于某些组织，每次免疫沉淀可能需要收获超过 25 mg。

组织/细胞 染色质总产率 预期 DNA 浓度
脾 20-30 μg/25 mg 组织 200-300 μg/ml
肝 10-15 μg/25 mg 组织 100-150 μg/ml
肾 8-10 μg/25 mg 组织 80-100 μg/ml
脑 2-5 μg/25 mg 组织 20-50 μg/ml
心脏 2-5 μg/25 mg 组织 20-50 μg/ml
Hela 10-15 μg/4 x 106 个细胞 100-150 μg/ml

附录 B：染色质消化的优化

将交联的染色质 DNA 消化成 150-900 个碱基对长度的最佳条件高度取决于 Micrococcal Nuclease 对消化中所用组织量或细胞数目的比率。以下是确定特定组织或细胞类型的最佳消化条件的实验步骤。

  1. 如第一、二和三部分中所述，从125 mg 组织或 2 X 107 个细胞（等同于 5 份 IP 制备物）制备交联的胞核。在第三部分的步骤 2 之后停止，并如下所述继续。
  2. 将 100 μl 胞核制备物转移入 5 个独立的 1.5 ml 微量离心管中，然后置于冰上。
  3. 向 27 μl 1X 缓冲液 B + DTT（1:10 酶稀释度）中添加 3 μl Micrococcal Nuclease 原液。
  4. 向步骤 2 中 5 支离心管的每支试管中添加 0 μl、2.5 μl、5 μl、7.5 μl 或 10 μl 稀释的 Micrococcal Nuclease，翻转离心管数次进行混合，然后在 37°C 下孵育 20 分钟，同时频繁混合。
  5. 添加 10 μl 0.5 M EDTA 并将离心管置于冰上以终止消化。
  6. 置于微量离心机中，在 4℃ 下以 16,000 x g 离心 1 分钟，使胞核沉淀，并移除上清液。
  7. 将胞核沉淀物用 200 μl 1X ChIP 缓冲液 + PIC 重悬。在冰上孵育 10 分钟。
  8. 用几个脉冲对裂解物进行声波处理以破坏胞核膜。脉冲间期，将样品置于湿冰上孵育 30 秒。可以通过在光学显微镜下观察声波处理前后的胞核，确定完全裂解胞核所需的最佳条件。通过使用设置为 6 且配有 1/8 英寸探头的 VirTis Virsonic 100 Ultrasonic Homogenizer/Sonicator，Hela 胞核在 3 组 20 秒的脉冲之后完全裂解。或者，可以通过将裂解物置于 Dounce 匀浆器中搅匀 20 次，裂解胞核；但是，裂解可能不完全。
  9. 在 4°C 下用微量离心机以 9,4000 x g 的离心力离心分离 10 分钟来使裂解物变澄清。
  10. 从每份超声处理的裂解物中取出 50 μl 转移至新的微量离心管。
  11. 向每份 50 μl 的样品中添加 100 μl 无核酸酶水、6 μl 5 M NaCl 和 2 μl RNAse A。涡旋混合并在 37°C 下孵育 30 分钟。
  12. 向每份 RNAse A 消化的样品中添加 2 μl Proteinase K。涡旋混合并在 65°C 下将样品孵育 2 小时。
  13. 从每份样品取出 20 μl，使其与 100 bp DNA 标准品在 1% 琼脂糖凝胶上进行电泳以确定 DNA 片段大小。
  14. 观察哪个消化条件能够产生所需 150-900 碱基对（1 至 5 个核小体）范围内的 DNA。优化实验步骤中能够获得所需 DNA 片段大小的 Micrococcal Nuclease 的稀释体积等于需添加至一份免疫沉淀制备物（25 mg 离散的组织细胞或 4 X 106 个组织培养细胞）以获得所需 DNA 片段大小的 Micrococcal Nuclease 原液体积的 10 倍。例如，如果在这个实验步骤中，5 μl 稀释的微球菌核酸酶产生 150-900 碱基对的 DNA 片段，则应当在第 III 部分中染色质消化期间添加 0.5 μl 微球菌核酸酶原液至一份 IP 制备物。
  15. 如果结果表明 DNA 的大小未在所需的范围内，则重复优化实验步骤，每次消化中相应调节 Micrococcal Nuclease 的量。或者，可以改变消化时间以提高或降低 DNA 片段化的程度。

附录 C：疑难排解指南

问题 可能的原因 建议
1. 消化的染色质浓度过低。 添加至染色质消化的细胞数不足，或者胞核在消化后未完全裂解。

如果染色质制备物的 DNA 浓度接近于 50 μg/ml，则向每次 IP 中添加额外的染色质以确保每次 IP 至少产生 5 μg，然后继续实验。

在交联之前计算备用平板上细胞的数量，以确定准确的细胞数量，和/或在声波处理前后在显微镜下观察胞核，以证实胞核完全裂解。
2. 染色质消化不足且片段过大（大于 900 bp）。

细胞可能已经过度交联。交联超过 10 分钟可能会抑制染色质的消化。

向染色质消化中添加过多细胞或未添加足够的 Micrococcal Nuclease。

在甲醛浓度固定的情况下进行一段时间。将交联时间缩短至 10 分钟或更短。

在交联之前计算备用平板上细胞的数量，以确定准确的细胞数量；有关染色质消化的优化，参见附录 B。
3. 染色质过度消化并且片段过小（只有 150 bp 单核小体的长度）。在 PCR 定量期间，将染色质完全消化成单核小体长度的 DNA 可能削弱信号，尤其对于长度大于 150 bp 的扩增子更是如此。 添加至染色质消化的细胞不足或 Micrococcal Nuclease 过多。 在交联之前计算备用平板上细胞的数量，以确定准确的细胞数量；有关染色质消化的优化，参见附录 B。
4. 样品输入对照组 PCR 反应中无产物或产物很少。

添加至 PCR 反应的 DNA 不足或条件不是最佳。

PCR 扩增区域可能跨越无核小体的区域。

添加至 IP 反应的染色质不足或染色质过度消化。

向 PCR 反应中添加更多 DNA 或增加扩增循环次数。

使用来自交联并消化后的染色质的纯化 DNA，优化实验引物组的 PCR 条件。

设计不同的引物组并将扩增子的长度减少到小于 150 碱基对（请参见第八部分中的引物设计建议）。为获得最佳 ChIP 结果，每次 IP 添加 5-10 μg 染色质。参见上述问题 1 和 3 的建议。
5. 阳性对照组蛋白 H3-IP RPL30 PCR 反应中无产物。

添加至 IP 反应的染色质或抗体不足，或者 IP 孵育时间过短。

蛋白 G 微珠中染色质洗脱不完全。

确保向每次 IP 反应中添加 5-10 μg 染色质和 10 μl 抗体并和抗体一起孵育过夜。在添加蛋白 G 微珠后需额外孵育 2 小时。

在 65℃ 下将染色质从蛋白 G 微珠洗脱为最佳，同时频繁混合以保持微珠悬浮在溶液中。
6. 阴性对照 Rabbit IgG-IP 和阳性对照 Histone H3-IP PCR 反应中产物的数量相等。

添加至 IP 反应的染色质过多或不足。或者，添加至 IP 反应的抗体过多。

添加至 PCR 反应的 DNA 过多或扩增循环次数过多。

向每次 IP 反应中添加不超过 15 μg 的染色质和 10 μl Histone H3 Antibody。每次 IP 将 Normal Rabbit IgG 缩减至1 µl/IP。

向 PCR 反应中添加更少的 DNA 或减少 PCR 循环次数。在 PCR 的线性扩增阶段范围内分析 PCR 产物极为重要。否则，不能准确测量起始 DNA 数量的差异。
7. 实验抗体 IP PCR 反应中无产物。

添加至 PCR 反应的 DNA 不足。

添加至 IP 反应的抗体不足。

抗体不适用于 IP。

向 PCR 反应中添加更多 DNA 或增加扩增循环次数。

通常，需向 IP 反应中添加 1 至 5 µg 的抗体；但是，实际加入量很大程度上取决于各个抗体本身。增加添加至 IP 反应的抗体量。

寻找其他替代抗体。

发布​时间 2011 年 12 月

修订时间 2018 年 6 月

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