免疫沉淀实验步骤（用于蛋白质免疫印迹分析）

如需更短的检测时间，请尝试使用我们的使用磁性分离法的免疫沉淀实验步骤（用于蛋白质免疫印迹分析）。

A. 溶液与试剂

注：用超纯水或相当的纯净水制备溶液。

1. 1X 磷酸盐缓冲液 (PBS)
2. 1X 细胞裂解缓冲液： (#9803) 20 mM Tris (pH 7.5)、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM EGTA、1% Triton X-100、2.5 mM 焦磷酸钠、1 mM β-甘油磷酸酯、1 mM Na₃VO₄、1 µg/ml 亮抑酶肽

注：使用前，立刻加入 1 mM PMSF。

3. Protein A 或 G 琼脂糖珠： (Protein A #9863)，请按照制造商的说明制备。使用蛋白 A 进行兔 IgG 沉淀，并用蛋白 G 进行小鼠 IgG 沉淀。
4. 3X SDS 样品缓冲液： (#7722) 187.5 mM Tris-HCl（pH 值6.8 ，25°C 条件），6% w/v SDS，30% 甘油，150 mM DTT，0.03% w/v 溴酚蓝

B. 制备细胞裂解物

1. 吸干培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基，使其对细胞进行处理一段时间。
2. 在非变性条件下收集细胞，去除培养基后用冰预冷的 PBS 洗涤细胞一次。
3. 去除 PBS，每块平板 (10 cm) 添加 0.5 ml 冰冷的 1X 细胞裂解缓冲液，平板放在冰上孵育 5 分钟。
4. 从板上刮下细胞，并且可将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
5. 在冰上可对样品进行 3 次超声粉碎，每次 5秒。
6. 以 14,000 x g 的离心力在 4°C 下微量离心 10 分钟，然后将上清液转移到新试管中。如有必要，裂解物可保存在 –80°C。

C. 免疫沉淀法

可选： 可能需要进行裂解物预澄清步骤，以减少与蛋白 A/G 琼脂糖微珠的非特异性结合（见下文部分）。

1. 取 200 μl 细胞裂解物，随后添加一抗。轻轻摇动，在 4°C 下孵育过夜。
2. 添加蛋白 A 或 G 琼脂糖微珠（20 μl 50% 珠浆）。轻柔震荡下在 4°C 孵育 1–3 小时。
3. 4°C 条件下微量离心 30 秒。用 500 µl 的 1X 细胞裂解缓冲液，洗涤沉淀物五次。洗涤间期，保持样品于冰上。
4. 使用 20 μl 3X SDS 样品缓冲液使沉淀物重新悬浮。涡旋振荡，然后再微量离心 30 秒。
5. 将样品加热到 95–100°C，持续 2-5 分钟，随后以 14,000 g 的离心力微量离心 1 分钟。
6. 将样品 (15–30 μl) 上样到 SDS-PAGE 凝胶 (12–15%) 上。
7. 用蛋白质印迹法分析样品（参见蛋白质免疫印迹实验步骤：蛋白印迹实验 BSA 或蛋白印迹实验牛奶）。

细胞裂解物预澄清（可选）

1. 取 200 μl 细胞裂解物并添加到蛋白 A 或 G 琼脂糖微珠（20 μl 50% 珠浆）中。
2. 在 4°C 下孵育 30-60 分钟。
3. 在 4°C 下旋转 10 分钟。将上清转移到新管中。
4. 继续进行步骤 1 的免疫沉淀。

注：对于分子量为 50 kDa 的蛋白，我们建议将 Mouse Anti-Rabbit IgG (Light-Chain Specific) (L57A3) mAb #3677 或 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb #3678 用作二抗，以最小化变性重链产生的遮蔽效果。对于分子量为 25 kDa 的蛋白，建议使用 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb #3678。