免疫沉淀实验步骤（用于激酶检测分析）

A. 溶液与试剂

注：用超纯水或相当的纯净水制备溶液。

1. 1X 磷酸盐缓冲液 (PBS)
2. 1X 细胞裂解缓冲液： (#9803) 20 mM Tris (pH 7.5)、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM EGTA、1% Triton X-100、2.5 mM 焦磷酸钠、1 mM β-甘油磷酸酯、1 mM Na₃VO₄、1 µg/ml 亮抑酶肽

注：使用前，立刻加入 1 mM PMSF。

1. Protein A Agarose Beads： (#9863) 添加 5 ml 1X PBS 到 1.5 g protein A agarose beads 中。在 4°C 下搅动 2 小时，以 14,000 g 的离心力离心分离 1 分钟使其沉淀。沉淀物用 PBS 洗涤两次。在 1 体积的 PBS 中重悬珠子。
2. 1X 激酶缓冲液： 25 mM Tris (pH 7.5)、5 mM β 甘油磷酸、2 mM DTT、0.1 mM Na₃VO₄、10 mM MgCl₂

B. 制备细胞裂解物

1. 吸干培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基，使其对细胞进行处理一段时间。
2. 在非变性条件下收集细胞，去除培养基后用冰预冷的 PBS 洗涤细胞一次。
3. 去除 PBS，每块平板 (10cm) 添加 0.5ml 1X 冰冷的细胞裂解缓冲液，平板放在冰上孵育 5 分钟。
4. 从板上刮下细胞，把提取物转移至微量离心管。置于冰上。
5. 在冰上声处理三次，每次 5 秒钟。
6. 在 4°C 下以 14,000 g 的离心力微量离心 10 分钟，随后将上清液转移到一根新的试管中。上清液即为细胞裂解物。如有必要，裂解物可保存在 –80°C。

C. 免疫沉淀法

注：对于使用固定一抗进行的免疫沉淀：添加 20 μl 固定的抗体珠浆到 200 μl 细胞裂解物中。轻轻摇动，在 4°C 下孵育过夜。继续进行洗涤步骤 3。

1. 添加一抗到 200 μl 细胞裂解物中；轻轻摇动，在 4°C 下孵育过夜。
2. 添加 protein A agarose beads（20 μl 50% 珠浆）。轻柔震荡下在 4°C 孵育 1–3 小时。
3. 4°C 条件下微量离心 30 秒。沉淀物用 500 μl 1X 细胞裂解缓冲液洗涤两次。洗涤间期，保持样品于冰上。
4. 使用 500 μl 1X 激酶缓冲液洗涤沉淀物两次。置于冰上。

D. 激酶测定法

1. 在 40 μl 1X 激酶缓冲液中重悬沉淀物，并再加入 200 μM ATP 和底物。
2. 在 30°C 下孵育 30 分钟。
3. 使用 20 μl 3X SDS 样品缓冲液终止反应。涡旋振荡，然后再微量离心 30 秒。
4. 将样品加热到 95–100°C 并持续 2–5 分钟。
5. 将样品 (15–30 μl) 上样到 SDS-PAGE 凝胶中。
6. 用蛋白质印迹法分析样品（请参阅蛋白质免疫印迹法实验步骤）