免疫沉淀法实验步骤/（针对变性蛋白）‭（IP/变性蛋白）

本实验步骤适用于变性蛋白的免疫沉淀法，此处变性蛋白的表位在天然构象中不可用。

A. 溶液与试剂

注：用超纯水或相当的纯净水制备溶液。

1. 细胞变性裂解缓冲液： 50 mM Tris（pH 值7.5），70 mM β-硫基乙醇 (β-ME) ，使用前再加入 β-ME。预沸腾持续 10 分钟。
2. 细胞裂解缓冲液 (1X)： (#9803) 20 mM Tris（pH 值7.5）、 150 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM EGTA、1% Triton X-100、2.5 mM 焦磷酸钠、1 mM β-甘油磷酸酯、1 mM Na₃VO₄和 1 µg/ml 亮抑酶肽

注：使用前，立刻加入 1 mM PMSF。

3. Protein A 或 G 琼脂糖珠： 将 Protein A (#9863)用于兔抗 IgG 沉淀实验，而 Protein G 用于鼠抗 IgG 沉淀实验。
4. 3X SDS 样品缓冲液： (#7722) 187.5 mM Tris-HCl（pH 值6.8 ，25°C 条件），6% w/v SDS，30% 甘油，150 mM DTT，0.03% w/v 溴酚蓝

B. 制备细胞裂解物

1. 吸干培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基，使其对细胞进行处理一段时间。
2. 在变性条件下收集细胞，去除培养基后，用 PBS 洗涤细胞一次。
3. 去除 PBS，每块平板 (150 x 25 mm) 添加 0.4 ml 变性细胞裂解缓冲液（使用前，立即预沸腾 10 分钟）。
4. 立即从板上刮除细胞并转移到 2.5 ml 管中。
5. 沸腾持续 10 分钟。
6. 加入 4 体积 (1.6 ml) 的 1X 冰上预冷细胞裂解缓冲液。这就是细胞裂解物。如有必要，裂解物可保存在 –80°C。

C. 免疫沉淀法

1. 将一抗加入到 200 µl 细胞裂解物中；轻柔震荡下在 4°C }过夜孵育。
2. 加入Protein A 或 G 琼脂糖珠（20 µl 的 50% 珠浆）轻柔震荡下在 4°C 孵育 1–3 小时。
3. 4°C 条件下微量离心 30 秒。用 500 µl 的 1X 细胞裂解缓冲液洗涤沉淀物 5 次。洗涤间期，保持样品于冰上。
4. 用 20 µl 3X SDS 样品缓冲液重悬沉淀物。涡旋振荡，然后再微量离心 30 秒。
5. 将样品加热到 95–100°C 并持续 2–5 分钟。
6. 将样品上样 (15–30 µl) 到 SDS-PAGE 凝胶 (12–15%) 上。
7. 用蛋白质印迹法分析样品（请参阅蛋白质免疫印迹法实验步骤）