重要事项:请参阅产品数据表首页或产品网页的应用板块,以确定该产品是否适用于石蜡包埋(IHC-P)的组织切片。
注:有关适当的抗体稀释、稀释剂和去掩蔽溶液,请参阅产品特定协议。
A. 溶液与试剂
注:利用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。
- 二甲苯。
- 无水变性乙醇,组织级(100% 和 95%)。
- 去离子水 (dH2O)。
- 洗涤缓冲液:
- 1X Tris Buffered Saline with Tween 20 (TBST):要制备 1 L 1X TBST,将 100 ml 10X Tris Buffered Saline with Tween 20 (TBST) (#9997) 加入 900 ml dH2O 中并混匀。
- *抗体稀释剂的选择:
- SignalStain® Antibody Diluent:(#8112)
- TBST/5% Normal Goat Serum:向 5 ml 1X TBST 中添加 250 µl Normal Goat Serum (#5425)。
- PBST/5% Normal Goat Serum:在 5 ml 1X PBST 中,加入 250 µl Normal Goat Serum (#5425)。
- 1X PBST:要制备 1 L 1X PBST,将 50 ml 20X Phosphate Buffered Saline with Tween 20 (PBST) (#9809) 加入 950 ml dH2O 中并混匀。
- 抗体修复剂的选择:
- 1X 柠檬酸盐修复液:要制备 250 ml 的 1X 柠檬酸盐修复液,将 25 ml 的 SignalStain® Citrate Unmasking Solution (10X) (#14746) 用 225 ml 的 dH2O 进行稀释。
- 1X EDTA 修复液:要制备 250 ml 的 1X EDTA 修复液, 将 25 ml 的 SignalStain® EDTA Unmasking Solution (10X) (#14747) 用 225 ml 的 dH2O 进行稀释。
- TE:10 mM Tris/1 mM EDTA, pH 值 9.0:要制备 1 L 溶液,将 1.21 g Tris 碱 (C4H11NO3) 和0.372 g EDTA (C10H14N2O8Na2•2H2O) 加入到 950 ml 的 dH2O 中。调整 pH 值至 9.0,然后用 dH2O 将最终溶液定容至 1 L。
- 胃蛋白酶:Tris-HCl,1 mg/ml , pH 值 2.0。
- 3% 过氧化氢:要制备 100 ml 溶液,将 10 ml 30% H2O2 加入到 90 ml dH2O 中。
- 封闭液:1X TBST/5% Normal Goat Serum 或者 1X Animal-Free Blocking Solution。
- 1X TBST/5% Normal Goat Serum:将 250 µl Normal Goat Serum (#5425) 加入到 5 ml 1X TBST 中。
- 1X Animal-Free Blocking Solution:在 4 mL 的 dH2O 中,加入 1 ml 的 Animal-Free Blocking Solution (5X) (#15019)。
- 检测系统:SignalStain® Boost IHC Detection Reagents (HRP, Mouse #8125; HRP, Rabbit #8114; HRP, Rat #72838; HRP, Goat #63707; AP, Mouse #31926; AP, Rabbit #18653; AP, Rat #15764; AP, Goat #26927)。
- 基质:HRP 兼容:SignalStain® DAB Substrate Kit (#8059);SignalStain® Vivid Purple Peroxidase Substrate Kit (#96632);AP 兼容:SignalStain® Vibrant Red Alkaline Phosphatase Substrate Kit (#76713)
- 苏木精:Hematoxylin (#14166)
- 封固剂:SignalStain® Mounting Medium (#14177)
B. 脱蜡/复水
注:务必使切片在制作过程中始终保持湿润状态。
- 脱蜡/水化合步骤:
- 将切片放入二甲苯的洗液中孵育 3 次,每次 5 分钟。
- 将切片放入 100% 乙醇中孵育切片 2 次,每次 10 分钟。
- 将切片放入 95% 乙醇中孵育切片 2 次,每次 10 分钟。
- 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。
C. 抗原修复
注:请参阅产品特定的协议,以获取有关揭露解决方案/实验步骤的具体建议。
- 对于柠檬酸盐:将切片浸入1 X 柠檬酸盐修复液,再放入微波炉中加热直至沸腾;继续保持亚沸腾温度(95°-98°)10 分钟。在实验台上冷却切片 30 分钟。
- 对于 EDTA:将切片浸入 1 X EDTA 修复液,再放入微波炉中加热直至沸腾;继续保持亚沸腾温度(95°-98°)15 分钟。无需冷却。
- 对 TE:将切片浸入 pH 值为 9.0 的 10 mM Tris/1 mM EDTA 溶液中,再放入微波炉中加热直至沸腾;继续保持亚沸腾温度(95°-98°)18 分钟。在实验台上冷却切片 30 分钟。
- 对于胃蛋白酶:37°C 消化 10 分钟。
D. 染色
注:有关推荐的抗体稀释剂,请参阅产品特定实验步骤。
- 用 dH2O 清洗切片三次,每次 5 分钟。
- 切片放入 3 % 过氧化氢水溶液中,孵育 10 分钟。
- 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。
- 用洗涤缓冲液清洗切片持续 5 分钟。
- 在每个切片上滴加 100–400 µl 首选封闭液,在室温下封闭 1 小时。
- 清除封闭液,然后每个切片加入用推荐的抗体稀释剂稀释的 100–400 µl 的一抗。
- 4°C 孵育过夜。
- 将 SignalStain® Boost Detection Reagent 平衡至室温。
- 清除抗体溶液,用洗涤缓冲液清洗切片 3 次,每次 5 分钟。
- 根据需要,滴入 1-3 滴 SignalStain® Boost Detection Reagent 覆盖切片。在加湿箱中室温孵育 30 分钟。
- 用洗涤缓冲液清洗切片 3 次,每次 5 分钟。
- 按照产品使用信息中的建议准备基材。
- 将 100-400 µl 底物涂在载玻片上。监控反应。推荐的反应时间因使用的底物而异。请参阅产品使用信息,以了解具体指南。
- 将切片浸入 dH2O 中。
- 如果需要,按照说明书使用 Hematoxylin (#14166) 将切片复染。
- 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。
- 使切片脱水:
- 在 95% 乙醇中孵育切片 2 次,每次 10 秒。
- 在 100% 乙醇中重复孵育 2 次,每次 10 秒。
- 在二甲苯中重复孵育 2 次,每次 10 秒。
- 用盖玻片和 SignalStain® Mounting Medium (#14177) 进行封片。
发布时间 2010 年 2 月
修订时间 2022 年 1 月