*重要事项:请参阅产品网页,以确定某种产品是否经验证以及是否获批用于冷冻组织切片。请参见产品网页,了解合适的抗体稀释度和修复液。
注:请参见产品网页,了解产品特定的实验步骤建议。
A. 溶液与试剂
注:利用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。
- 二甲苯。
- 乙醇(无水变性,组织学分级 100% 和 95%)。
- 苏木精(可选)。
- 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS):( #9808) 为了制备 1 L 1 X PBS:添加 50 ml 20 X PBS 至 950 ml dH2O,然后将其混匀。
- 固定液选择:请参阅产品数据表,以了解最佳的固定液。
- 10% 中性缓冲福尔马林。
- 丙酮。
- 甲醇。
- 3% 甲醛:要制备 100 ml 溶液,将 18.75 ml 16% 的甲醛加入到 81.25 ml 的 1X PBS 中。
- 10X Tris 盐缓冲液 (TBS) 洗涤缓冲液:(#12498) 要制备 1 L 1X TBS 溶液,将 100 ml 的 10X TBS 加入 900 ml dH2O 中,并混匀。
- 甲醇/过氧化物酶:制备方法:将 10 ml 30% H2O2 加入到 90 ml 甲醇中。储存于 -20°C 的温度下。
- 封闭液:1X TBS/0.3% Triton X-100/5% Normal Goat Serum (#5425)。制备方法:将 500 µl 的山羊血清和 30 µl 的 Triton X-100 加入到 9.5 ml 的 1X TBS 中。
- 检测系统:SignalStain® Boost IHC Detection Reagents (HRP, Mouse #8125; HRP, Rabbit #8114)。
- 基质:SignalStain® DAB Substrate Kit (#8059)。
B. 切片制作
- 针对储存在 -80°C 温度下的组织:切片前,从冷冻柜中取出组织样品,在 -20°C 的温度下均衡约 15 分钟。这样可以防止切片在封闭时破裂。
- 将组织切成厚度在 6–8 µm 之间的切片,置于带正电荷的载玻片上。
- 固定前,将切片放置在工作台上风干几分钟(这样可以增加切片的粘附作用)。
C. 固定剂的选择
注:请参考产品数据表,确定最佳的固定剂。
- 组织切片晾干后,按照以下步骤使用最佳的固定剂固定。
- 10% 中性缓冲福尔马林:在室温下固定10 分钟。立即进入染色步骤(D 部分)。
- 冷冻丙酮:-20°C 温度下,冷冻 10 分钟。风干。立即进行染色(D 部分)。
- 甲醇:-20°C 温度下,冷冻 10 分钟。立即进行染色(D 部分)。
- 3% 甲醛:在室温下固定15 分钟。立即进行染色(D 部分)。
- 3% 甲醛/甲醇:在3% 甲醛溶液中室温固定 15 分钟,之后在 -20°C 的温度下在甲醇溶液中固定 5 分钟(转移过程中不要冲洗)。立即进行染色(D 部分)。
D. 染色
- 用洗涤缓冲液清洗切片两次,持续 5 分钟。
- 在甲醇/过氧化物酶中室温孵育 10 分钟。
- 用洗涤缓冲液清洗切片两次,持续 5 分钟。
- 在每个切片上滴加 100–400 µl 封闭液,在室温下封闭 1 小时。
- 清除封闭液,然后每个切片加入用封闭液稀释的 100–400 µl 的一抗。
- 4°C 孵育过夜。
- 将 SignalStain® Boost Detection Reagent 平衡至室温。
- 清除抗体溶液,在洗涤缓冲液中清洗切片 3 次,每次 5 分钟。
- 根据需要,滴入 1-3 滴 SignalStain® Boost Detection Reagent。在加湿箱中室温孵育 30 分钟。
- 用洗涤缓冲液清洗切片 3 次,每次 5 分钟。
- 加入 1 滴 (30 µl) SignalStain® DAB Chromogen Concentrate 至 1 ml 的 SignalStain® DAB Diluent 中,使用前充分混合。
- 在每张切片上应用 100–400 µl SignalStain® DAB,并密切观察,通常 1–10 分钟即可得到合适的染色强度。
- 将切片浸入 dH2O 中。
- 如有需要,可根据制造商的说明使用苏木精对切片进行复染。
- 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。
- 使切片脱水:
- 在 95% 乙醇中孵育切片 2 次,每次 10 秒。
- 在 100% 乙醇中重复孵育 2 次,每次 10 秒。
- 在二甲苯中重复孵育 2 次,每次 10 秒。
- 用盖玻片盖住切片。
发布时间 2010 年 2 月
修订时间 2013 年 11 月