重要事项：请参考数据表首页的应用部分，以确定该产品是否已经验证并获批用于本实验步骤。
A. 溶液与试剂
注：用超纯水或相当的纯净水制备溶液。
- 10 X 磷酸盐缓冲液 (PBS)：为了配制 1 L，添加 80 g 氯化钠 (NaCl)、2 g 氯化钾 (KCl)、14.4g 磷酸氢二钠 (Na2HPO4) 和 2.4g 磷酸二氢钾 (KH2PO4) 至 1 L dH2O。调节 pH 至 8.0。
- 甲醛（16%，不含甲醇，Polysciences, Inc.，货号 18814），使用新鲜制剂，打开的小瓶避光保存在 4°C 下，用 PBS 稀释后使用。
- 辛基 β-D-吡喃葡萄糖苷 (n-Octyl-Glucoside)，≥ 98%，Sigma-Aldrich （货号：O8001），在 dH2O 复溶，以供使用。
- 封闭缓冲液 (1X PBS / 5% normal goat serum (#5425) / 0.5% n-Octyl-Glucoside)：
要制备 25 ml，添加 2.5 ml 10X PBS、1.25 ml 与二抗同一物种来源的正常血清（如常规山羊血清、常规驴血清） 和 21.25 ml dH2O，混匀。搅拌同时添加 n-Octyl-Glucoside，至 0.5% 的终浓度。
- 抗体稀释缓冲液 (1X PBS / 1% BSA / 0.5% n-Octyl-Glucoside)：
要制备 40 ml 溶液，将 4 ml 10X PBS 加入到 36 ml dH2O 中并混匀。加入 0.4 g BSA 并混匀。搅拌同时添加 n-Octyl-Glucoside，至 0.5% 的终浓度。
- 荧光物质偶联的二抗（建议使用的二抗）
注：首次使用一抗或荧光素标记二抗时，将抗体滴定至最佳稀释比例，使样品在最少的背景干扰下，获得最强的特异性信号。
- Prolong Gold AntiFade Reagent (#9071), with DAPI (#8961)。
B. 标本制备 - 培养细胞系 (IF-IC)
注：细胞应当在多孔板、腔室玻片或盖玻片上直接培养、处理、固定和染色。
- 吸干液体，随后在细胞上覆盖一层 2–3 mm 用 PBS 稀释的 4% 甲醛。
注：甲醛有毒性，仅限在通风橱中使用。
- 室温下固定细胞 15 分钟。
- 吸干固定液，用 PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
- 继续进行免疫染色操作（C 部分）。
C. 免疫染色
注：所有随后的孵育都应当在室温下完成，除非另外注明需要在潮湿光密盒或带盖的培养皿/板中孵育，以防止干燥和荧光物质淬灭。
- 将样本封闭在缓冲液中（包含 0.5% n-Octyl-Glucoside） 60 分钟。
- 封闭期间，通过按数据表中的指示在抗体稀释缓冲液（包含 0.5% n-Octyl-Glucoside）中稀释样本来制备一抗。
- 吸去封闭缓冲液，加入稀释后的一抗。
- 4°C 温度下孵育过夜。
- 用 PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
注：如果使用直接偶联 Alexa Fluor® 荧光物质的一抗，则跳到步骤 C10。
- 样品用在抗体稀释缓冲液（含有 0.5% n-Octyl-Glucoside）中稀释的荧光物质偶联二抗*室温孵育 1-2 小时，避光。
- 按照步骤 7，使用 PBS 漂洗。
- 使用 Prolong Gold Antifade Reagent (#9071), with DAPI (#8961) 对玻片封盖。
- 为达到最佳效果，立即以适当的激发波长检测标本。将切片平放避光 4°C 环境下，可长期保存。
*推荐的二抗：
兔抗
鼠抗
抗大鼠
