使用明胶封闭步骤的免疫荧光实验步骤

重要事项：请参考数据表首页的应用部分，以确定该产品是否已经验证并获批用于本实验步骤。

A. 溶液与试剂

注：用超纯水或相当的纯净水制备溶液。

• 10 X 磷酸盐缓冲液 (PBS)：为了配制 1 L，添加 80 g 氯化钠 (NaCl)、2 g 氯化钾 (KCl)、14.4​g 磷酸氢二钠 (Na₂HPO₄) 和 2.4​g 磷酸二氢钾 (KH₂PO₄) 至 1 L dH₂O。调节 pH 至 8.0。
• 甲醛（16%，不含甲醇，Polysciences, Inc.，货号 18814），使用新鲜制剂，打开的小瓶避光保存在 4°C 下，用 PBS 稀释后使用。
• 明胶， 2%， SIGMA （目录# G1393)
• 封闭缓冲液（1X PBS / 0.2% 明胶）：
  要制备 25 ml，添加 2.5 ml 10X PBS 和 2.5 ml 明胶到 20 ml dH₂O 中。混匀。
• 抗体稀释缓冲液 (1X PBS / 1% BSA / 0.3% Triton X-100)：
  要制备 40 ml 溶液，将 4 ml 10X PBS 加入到 36 ml dH₂O 中并混匀。加入 0.4 g BSA 并混匀。搅拌时加入 120 µl Triton X-100。
• 荧光物质偶联的二抗（建议使用的二抗）
  注：首次使用一抗或荧光素标记二抗时，将抗体滴定至最佳稀释比例，使样品在最少的背景干扰下，获得最强的特异性信号。
• Prolong Gold AntiFade Reagent (#9071), with DAPI (#8961)。

B. 标本制备 - 培养细胞系 (IF-IC)

注：细胞应当在多孔板、腔室玻片或盖玻片上直接培养、处理、固定和染色。

1. 吸干液体，随后在细胞上覆盖一层 2–3 mm 用 PBS 稀释的 4% 甲醛。
   注：甲醛有毒性，仅限在通风橱中使用。
2. 室温下固定细胞 15 分钟。
3. 吸干固定液，用 PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
4. 继续进行免疫染色操作（C 部分）。

C. 免疫染色

注：所有随后的孵育都应当在室温下完成，除非另外注明需要在潮湿光密盒或带盖的培养皿/板中孵育，以防止干燥和荧光物质淬灭。

1. 在封闭缓冲液中封闭标本 60 分钟。
2. 封闭标本时，按照说明书中推荐的稀释比例，在抗体稀释缓冲液中配制一抗。
3. 吸去封闭缓冲液，加入稀释后的一抗。
4. 4°C 温度下孵育过夜。
5. 用 PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
   注：如果使用与 Alexa Fluor^® 荧光物质直接偶联的一抗，则跳到步骤 C8。
6. 在用抗体稀释缓冲液稀释的荧光素偶联的二抗中，室温孵育样品 1-2 小时，避光。
7. 按照步骤 5，使用 PBS 漂洗。
8. 使用 Prolong Gold Antifade Reagent (#9071), with DAPI (#8961) 对玻片封盖。
9. 为达到最佳效果，应立即采用适当的激发波长检测标本。将切片平放避光 4°C 环境下，可长期保存。

*推荐的二抗：

兔抗

• Anti-Rabbit IgG (H+L)，F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 488 Conjugate) #4412
• Anti-Rabbit IgG (H+L)，F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 555 Conjugate) #4413
• Anti-Rabbit IgG (H+L)，F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 647 Conjugate) #4414

鼠抗

• Anti-Mouse IgG (H+L)，F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 488 Conjugate)#4408
• Anti-Mouse IgG (H+L)，F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 555 Conjugate)#4409
• Anti-Mouse IgG (H+L)，F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 647 Conjugate)#4410

抗大鼠

• Anti-Rat IgG (H+L), (Alexa Fluor^® 488 Conjugate) #4416
• Anti-Rat IgG (H+L), (Alexa Fluor^® 555 Conjugate) #4417
• Anti-Rat IgG (H+L), (Alexa Fluor^® 647 Conjugate) #4418