甲醛固定的免疫荧光实验步骤

重要事项：本实验步骤对未标记和荧光标记的抗体均适用。请参阅产品网页或产品数据表上的产品使用信息部分，以确定该产品是否已通过验证并批准用于培养细胞系（IF-IC）或冷冻组织切片（IF-F） 。

注：某些 CST® 抗体在使用其他操作步骤时才能发挥最佳性能。请参见产品网页上的实验步骤，了解针对特定产品的建议。

A. 溶液与试剂

若想获得高质量的免疫荧光图片，请使用我们的 Immunofluorescence Application Solutions Kit (#12727) 中高效且划算的预制试剂。

注：利用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

• 1X Phosphate Buffered Saline (PBS)： 要配制 1 L 1X PBS：添加 100 ml 10X 洗涤缓冲液、磷酸盐缓冲盐水 (#12528) 到 900 ml dH₂O 中，混匀。调节 pH 至 8.0。
• 4% 甲醛，不含甲醇 (#47746)：使用新鲜溶液。
• 封闭缓冲液：购买即用型免疫荧光封闭液 (#12411)，或通过添加 0.5 mL 与二抗同一物种来源的正常血清（例如，正常山羊血清 (#5425)）和 30 µL Triton X-100 到 9.5 mL 1X PBS 中来制备 1X PBS /5% 正常血清 /0.3% Triton X-100 缓冲液。4°C 保存。
• 抗体稀释缓冲液： 购买即用型免疫荧光抗体稀释缓冲液 (#12378)，或通过添加 0.1 g BSA (#9998) 和 30 µL Triton X-100 至 10 mL 1X PBS 中来制备 1X PBS / 1% BSA /0.3% Triton X-100 缓冲液。4°C 保存。
• 荧光素偶联的二抗： 使用对您的一抗宿主物种（例如兔子）具有反应性的二抗。单击此处获得批准用于免疫荧光法的二抗列表。

B. 固定

注：所有后续孵育都应在室温（20-25°C）下进行， 除非另有说明。

1. 对固定的冷冻组织（IF-F）进行免疫染色（C 部分）。
2. 对于培养的细胞系（IF-IC）或未固定的冷冻组织切片（IF-F），请立即固定，如下所示：
   1. 用 4％ 的甲醛将样品覆盖到 2–3 mm 的深度。
   2. 让标本在室温下固定 15 分钟。
   3. 用 PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
   4. 继续进行免疫染色操作（C 部分）。

C. 免疫染色

1. 在封闭缓冲液中封闭标本 60 分钟。
2. 封闭时，在抗体稀释缓冲液中制备一抗（建议的稀释范围请参见产品网站）。
3. 吸出封闭溶液，然后加入稀释后的一抗。
4. 4°C 温度下孵育过夜。
5. 用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。

注：如果使用荧光物质标记的一抗，则跳转到 Ｃ部分，第 8 步。

6. 用抗体稀释缓冲液将荧光素偶联的二抗稀释后，避光孵育标本 1–2 小时。
7. 用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟，使其避光。
8. 适当的复染。

注：在您的实验中加入荧光细胞染料（包括 DNA 染料等）时，请参考染料产品页，以了解建议的实验步骤。查看我们的经验证用于免疫荧光分析的细胞染料列表。

9. 安装样品进行成像。
10. 为了长期保存，请在 4°C 下避光保存样品。