HRP 化学发光 ELISA-P

A. 溶液与试剂

1. 碳酸盐缓冲液： 15 mM Na₂CO₃、35 mM NaHCO₃、0.2 g/l NaN₃ (pH 9.6)。将 1 µM 合成肽加入碳酸盐缓冲液中。
2. 10 X 磷酸盐缓冲液 (PBS)：要配制 1L，添加 80g 氯化钠 (NaCl)、2g 氯化钾 (KCl)、14.4​g 磷酸氢二钠 (Na₂HPO₄) 和 2.4​g 磷酸一氢钾 (KH₂PO₄) 到 1L dH₂O 中。调节 pH 至 7.4。
3. 洗涤缓冲液：含有 0.05% Tween 20 的 1 X PBS (PBST)
4. 封闭缓冲液：PBST 中 10 mg/ml 牛血清白蛋白 (BSA)
5. 一抗稀释缓冲液： 用 PBST 配制 1 mg/ml BSA
6. 二抗稀释缓冲液： 3% BSA 稀释于 PBST 中
7. 96-孔平板： 化学发光检测建议使用纯白或不透明的平板。

B. 让肽结合 96 孔平板

1. 对于 96 孔微滴定平板的各孔，用通过碳酸盐缓冲液配制的 100 µl 1µM 合成肽包被，在 4°C 下孵育过夜，或在 37°C 下孵育 2-6 小时。如果肽不结合或不吸附，可尝试pH在4–8 内的其他缓冲液。
2. 平板按 200 µl/孔用洗涤缓冲液洗涤三次。
3. 在 37°C 下，平板按 200 µl/孔用封闭缓冲液封闭 1 小时。将洗涤缓冲液洗涤平板 3 次。（如果需要，可以持续 1-2 个月将平板保持在 4°C ）

C. HRP 偶联一抗的实验步骤

1. 使用一抗稀释缓冲液配制建议稀释度的 HRP 偶联一抗。向各孔添加 100μl，并在 37°C 孵育 1 小时。
2. 用洗涤缓冲液洗涤 5 次。
3. 通过混合等量的 Luminol/Enhancer Solution (# 7003) 和 Stable Peroxide Buffer 来配制工作液。
4. 在添加底物后的 1–10 分钟内，使用平板光度计来测量在 425nM 处的相对光单位 (RLU)。
5. 在 10 分钟内读取以获得最佳信号强度。

D. HRP 偶联二抗的实验步骤

1. 使用一抗稀释缓冲液配制建议稀释度的一抗溶液。向各孔添加 100 µl，并在 4°C 下孵育过夜，或在 37°C 下孵育 2-6 小时。
2. 用洗涤缓冲液洗涤 3 次。
3. 使用二抗稀释缓冲液配制建议稀释度的 HRP 偶联二抗。向各孔添加 100μl，并在 37°C 孵育 1 小时。
4. 用洗涤缓冲液洗涤 5 次。
5. 通过混合等量的 Luminol/Enhancer Solution (# 7003) 和 Stable Peroxide Buffer 来配制工作液。
6. 在添加底物后的 1–10 分钟内，使用平板光度计来测量在 425nM 处的相对光单位 (RLU)。
7. 在 10 分钟内读取以获得最佳信号强度。

*建议的 HRP 偶联二抗：

• Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody #7074
• Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody #7076
• Anti-rat IgG, HRP-linked Antibody #7077