Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase (G6PD) Activity Assay Kit #12581 的检测实验步骤

产品专有： Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase (G6PD) Activity Assay Kit #12581.

A. 仪器

1. 使用约 530 nm 激发波长和 590 nm 发射波长读取 96 孔板的读板机。
2. 96 孔黑色培养板。

B. 试剂配制

1. 请重新配制以下冻干组分：

   组分	dH2O 体积
   G6PDH 底物	250 μL
   G6PDH 显色剂	100 μL
   G6PDH 阳性对照	50 μL
   NADP	100 μL
   G6PDH 辅因子	100 μL

2. 计算检测次数：样品 + 阳性对照数量。
3. 根据计算的检测次数，稀释总检测溶液。
   • 对于 96 孔板，建议 70 μL/孔
   • 对于 384 孔板，建议 20 μL/孔。

检测次数 = 10 份样品 (n=3) + 3 份阳性对照

• 96 孔板：70 μL/孔 x 33 份样品 = 2310 μL + 10% = 约 2500 μL
• 384 孔板：20 μL/孔 x 33 份样品 = 660 μL + 10% = 约 750 μL
4. 配制阴性对照溶液（参见表格）

注：请勿将 G6PD 底物添加到阴性对照溶液中。

5. 配制阳性对照溶液（参见表格）
6. 配制 1X 细胞裂解缓冲液

表 1：96 孔板中 10 份样品的计算示例（所有样品均为三份）

表 2：384 孔板中 10 份样品的计算示例（所有样品均为三份）

C. 制备细胞裂解物

对于贴壁细胞

1. 将靶细胞培养至融合度为 80–90% 并吸干培养基。
2. 按所需时间添加含有调节分子的新鲜培养基。
3. 吸干培养基，细胞用冰冷的 1 X PBS (#9872) 漂洗一次。
4. 吸干 PBS，每块平板（直径为 10cm）添加 0.5ml 冰冷的 1 X 细胞裂解缓冲液和 1 mM PMSF。
5. 培养板放在冰上孵育 5 分钟。
6. 从平板刮下细胞并转移至适当的试管。置于冰上。
7. 在冰上超声处理裂解物。
8. 在 4°C 微量离心 10 分钟（x14,000 转/分钟），并将上清液转移至一个新试管。上清液即为细胞裂解物。
9. 按一次性等量样品保存在 -80°C 下。

对于悬浮细胞

1. 当培养物达到 0.5–1.0 x 10⁶ 个活细胞/ml 时，通过低速离心（约 1200 转/分钟）移除培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基，使其对细胞进行处理一段时间。
2. 通过低速离心（约 1200 转/分钟）收集细胞并用 5–10 ml 冰冷的 1 X PBS 洗涤一次。
3. 从 50 ml 生长培养基中收获的细胞可在 2.0 ml 1X 细胞裂解缓冲液和 1 mM PMSF 中进行裂解。
4. 在冰上超声处理裂解物。
5. 在 4°C 微量离心 10 分钟（x14,000 转/分钟），并将上清液转移至一个新试管。上清液即为细胞裂解物。按一次性等量样品保存在 -80°C 下。

D. 检测实验步骤

1. 用 G6PD 检测缓冲液 (1X) 稀释样品至所需浓度。
2. 向一块黑色 96 孔板添加 70 μL 总检测溶液和 30 μL 样品。混匀。（或向一块 384 孔板添加 20 μL 总检测溶液和 10 μL 样品。）
3. 阴性对照：向三个孔添加 100 μL 阴性对照溶液。（向 384 孔板添加 30 μL 阴性对照溶液。）
4. 阳性对照：向三个孔添加 70 μL 总检测溶液和 30 μL 阳性对照溶液。混匀。（向 384 孔板添加 20 μL 总检测溶液和 10 μL 阳性对照溶液。）
5. 在 37°C 孵育 15 分钟。
6. 使用约 540 nm 的激发波长和约 590 nm 的发射波长读取读板机上的 RFU。